第一章 蛋白质的结构和功能

第一章蛋白质的结构和功能黄剑第一章蛋白质的结构和功能第一章蛋白质的结构与功能

蛋白质译自Albuminoid，该词来自拉丁文Albumina（蛋白）。1838年，德国化学家Mulder建议采用Protein一词，立即得到瑞典著名化学家Berzelius的支持，逐渐被学术界普遍采用，该词源自希腊文προτο（proteios），意为最原始、最基本、最重要的。可见，蛋白质自发现后一直受到化学家和生物学家的重视。因为蛋白质是活细胞中含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，是各种生物功能主要的体现者。近代生物化学及分子生物学研究表明，蛋白质是由20种左右的α-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学活性的高分子有机化合物。它广泛存在于生物界，是塑造一切组织和细胞结构必不可少的组成成分，是生命的支柱；每种蛋白质在实现细胞内协调一致的活动中扮演着各自特定的角色，如参与细胞结构的建造，起支持和保护作用。生命的最基本特征是能够进行新陈代谢，新陈代谢所包括的一切化学反应都是在生物催化剂——酶的作用下完成的；几乎所有的酶都是蛋白质。第一章蛋白质的结构和功能

蛋白质是以核酸为模板合成的，是基因表达的主要产物，因此人们将核酸称为“遗传大分子”，而把蛋白质称为“功能大分子”。近50年来，以核酸-蛋白质的结构、功能及其相互关系为中心，逐渐形成了分子生物学，成为带领生命科学进入新时代的龙头。蛋白质是20种天然氨基酸缩合成的大分子，分子量从10kDa至数百kDa，有着极其复杂的结构。1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang提出蛋白质三级结构概念，把蛋白质研究纳入正轨。

第一章蛋白质的结构和功能

越来越多的证据雄辩地表明：蛋白质的功能与其特殊的结构有着十分密切的内在联系，结构是特定功能的内在依据，功能则是特定结构的外在表现。

因此，阐明蛋白质的分子结构及其与功能的关系是现代生物化学的基本命题，是揭示生命运动规律的必由之路，应当受到所有生命科学工作者的关注。第一章蛋白质的结构和功能1蛋白质的基本组成单位——氨基酸

氨基酸(aminoacid)是一类分子中含有氨基的羧酸，广泛分布于生物界。目前从各种不同的生物体中发现的氨基酸已有250多种，其中有20种是蛋白质分子结构的基本成分，可称为蛋白质氨基酸；更多的氨基酸则以游离形式存在，不参与蛋白质的结构组成，称为非蛋白质氨基酸。本节将以蛋白质氨基酸为中心，对它们的结构和性质进行分析和讨论。

1819年，法国化学家布拉孔诺(H·Braconnot)把纤维素放在酸里加热，成功地把纤维素水解为葡萄糖，从而知道纤维素是由许许多多的葡萄糖“手拉手”组成的，因此他想，能不能像研究纤维素那样来研究蛋白质的组成呢?首先他把明胶放在酸里加热，结果从酸水解液中分离到一种分子量比蛋白质小得多的含氮化合物，后来取名为甘氨酸；他又用同样方法从肌肉水解液中提取出另一种含氮化合物，因它的结构中含氨基和羧基，故取名为氨基酸。第一章蛋白质的结构和功能1.1氨基酸的分子结构

1.1.1蛋白质氨基酸

在蛋白质水解液中分离出来的氨基酸有20种，它们都属α-氨基酸，除脯氨酸外，在与羧基相连的α-碳原子上都有1个氨基。其分子结构的通式表示如下第一章蛋白质的结构和功能第一章蛋白质的结构和功能第一章蛋白质的结构和功能

脯氨酸与一般的α-氨基酸不同，它没有自由的α-氨基，是一种α-亚氨基酸，可以看作是α-氨基酸的侧链基团(-CH2CH2CH3)取代了自身氨基上的一个氢原子而形成的杂环结构。脯氨酸的分子结构表示如下：α-氨基酸脯氨酸第一章蛋白质的结构和功能

天然的α-氨基酸除甘氨酸外，α-碳原子均为不对称碳原子。有的α-氨基酸可能含有两个或两个以上的不对称碳原子，因此它们都有旋光性，分为D-型和L-型两种异构体。对这一类氨基酸的立体化学研究证明，所有带α-氨基的碳原子都具有相同的构型，而且这些构型和L-(-)甘油醛相同(见下图)。因此，这些氨基酸均属L-α-氨基酸，这是蛋白质氨基酸分子结构的共同特征。第一章蛋白质的结构和功能

根据20种蛋白质氨基酸分子结构的这种特点，可按R基团的化学结构，将其分为脂肪族、芳香族和杂环族氨基酸三类。脂肪族氨基酸:有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨、谷氨酸、赖氨酸及精氨酸；芳香族氨基酸:有苯丙氨酸及酪氨酸；杂环族氨基酸:有色氨酸、组氨酸及脯氨酸。第一章蛋白质的结构和功能脂肪族氨基酸杂环氨基酸芳香族氨基酸第一章蛋白质的结构和功能

氨基酸的R基团的结构不同，使各种氨基酸具有不同的性质。实际上，蛋白质的许多性质、结构和功能等在很大程度上与氨基酸的R基团密切相关。根据20种氨基酸R基团的极性和解离性质，可将它们分为以下4组：

(1)非极性R基团氨基酸：该组氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸及脯氨酸等8种。它们的侧链均为非极性基团，呈现疏水性第一章蛋白质的结构和功能非极性R基团氨基酸：侧链基团均为非极性基团，呈现疏水性。第一章蛋白质的结构和功能（2）不解离的极性R基团氨基酸这一组包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺及甘氨酸等7种。它们的侧链中含有不解离的极性基团，能与水形成氢键。因此比非极性R基团氨基酸易溶于水。

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(3)荷正电R基团氨基酸共有3种。其中赖氨酸除α-氨基外，在烃链ε位上还有一个氨基；精氨酸含有一个胍基；组氨酸有一个弱碱性的咪唑基。这一组氨基酸的R基团在pH7溶液中，可质子化而使分子带正电荷。因此，通常将这3种氨基酸称为碱性氨基酸。第一章蛋白质的结构和功能(4)荷负电R基团氨基酸该组氨基酸有2种，即谷氨酸和天冬氨酸。它们都含有两个羧基，即除α-羧基外，在侧链上还有一个非α-羧基。在pH7环境中，侧链羧基可完全解离，使分子带负电荷。因此，这一组氨基酸也称作酸性氨基酸。

第一章蛋白质的结构和功能1.1.2非标准蛋白质氨基酸

在蛋白质的氨基酸组成分析时，发现某些蛋白质除了上述20种标准氨基酸外，还含有其他结构形式的氨基酸。这些特殊的氨基酸不具有独立的遗传密码，它们是在蛋白质多肽链翻译过程中，通过相应的标准氨基酸残基的化学修饰而形成的。它们的存在与蛋白质的结构和功能有着密切的关系。第一章蛋白质的结构和功能

蛋白质中所含的非标准氨基酸最突出的例子是4-羟脯氨酸(4-hydroxyproline)及5-羟赖氨酸(5-hydroxylysine)，它们是纤维状蛋白质——胶原的重要结构成分。第一章蛋白质的结构和功能一些与核酸结合形成复合物的蛋白质，它们的某些氨基酸残基往往被化学修饰。例如核糖体蛋白质及染色体蛋白质(组蛋白)中的氨基酸常被甲基化、乙酰化或磷酸化，形成相应的氨基酸衍生物，如3-甲基组氨酸、O-磷酸丝氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸、N-乙酰丝氨酸、ω-N,N,N-三甲基赖氨酸、N,N,N一三甲基丙氨酸等。所有原核生物的蛋白质在生物合成之初，其N-末端残基均为N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine)，随后在蛋白质修饰成熟过程中被去除。第一章蛋白质的结构和功能在凝血酶原及某些具有结合Ca2+功能的蛋白质中，含有γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamicacid)。第一章蛋白质的结构和功能在弹性蛋白中，发现含有一个结构更复杂的氨基酸——锁链素(desmcosine)，它是赖氨酸的衍生物，由4个赖氨酸分子组成吡啶环，位于分子中央。第一章蛋白质的结构和功能在甲状腺球蛋白中，存在有碘化的酪氨酸残基，它们可进一步修饰转变，并经蛋白质降解生成甲状腺素(thyroxine)和三碘甲腺原氨酸(triiodothyryronine)。

第一章蛋白质的结构和功能1.1.3非蛋白质氨基酸（天然氨基酸）

在生物界还存在许多其他的氨基酸，其中多数以游离形式存在于生物的组织和细胞中，少数则与其他有机化合物结合，形成具有特定生物学活性的复合物。尽管当前对这一类氨基酸的生物学功能尚未完全了解，但对其中部分氨基酸的功能正在被阐明。第一章蛋白质的结构和功能

据目前所知，非蛋白质氨基酸的生物学功能主要表现在以下几方面：

(1)作为细胞与细胞之间信息传递的介质或参于物质代谢的调节。如γ

-氨基丁酸(-Aminobutyricacid)、甲状腺素等。

(2)它们是物质代谢过程的中间产物或重要代谢物的前体，活泼地参与体内各种代谢反应。如鸟氨酸(ornithine)、瓜氨酸(citrullirne)、同型半胱氨酸(高半胱氨酸，homocysteine)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylnlethionine)、β-丙氨酸等。第一章蛋白质的结构和功能(3)具有特异的生理活性，是医学上常用的抗生素或抗代谢药物。如重氮乙酰丝氨酸(Azaserine)，它由一种链丝菌产生或合成，能抑制嘌呤的生物合成，导致染色体畸变。

(4)在不少生物体如细菌中，广泛存在一类D型氨基酸，它们是微生物细胞壁的结构成分。实验证明，D型氨基酸的存在，可降低细菌细胞壁对肽酶作用的敏感性，保护菌体不受酶作用的损害。第一章蛋白质的结构和功能1.2氨基酸的理化性质

1.2.1氨基酸的两性解离

氨基酸均为无色晶体或粉末状，每种氨基酸都有自己特有的晶体形状，可用于鉴定。与相应的有机酸相比，氨基酸的熔点较高，通常大于200ºC，如甘氨酸为232ºC，而相应的乙酸的熔点仅为16.5ºC。氨基酸至少含有两个可解离基团，具有可解离的侧链基团者，则有3个解离基团。在某种pH环境中，氨基酸的羧基可解离释放出质子，具有酸的性质；而它的氨基可以接受质子，具有碱的性质。因此，氨基酸既能与酸也能与碱反应，形成盐，呈现两性电解质的特性。第一章蛋白质的结构和功能氨基酸与酸或碱反应的过程表示如下：由此可见，在水溶液中，一种氨基酸处在相对酸的条件下，带正电荷；在相对碱的条件下，带负电荷；当溶液的pH达到某一特定值时，该氨基酸则带有相等的正电荷及负电荷，形成分子内盐。此时的氨基酸净电荷等于零，呈现电中性。处于电中性时的氨基酸称偶极离子(dipolarion)或兼性离子(zwitterion)，此时溶液的pH值称为等电点(isoelectricpoint，pI)。第一章蛋白质的结构和功能pI值是氨基酸的一个特性参数。氨基酸在溶液中所带电荷的性质决定于该氨基酸的pI值与溶液pH值的关系。当溶液的pH<pI时，氨基酸带正电荷；当溶液的pH>pI时，氨基酸带负电荷；当溶液的pH=pI时，氨基酸以兼性离子状态存在。不同氨基酸因所含可解离基团，如氨基和羧基数目不同及各种基团相对解离程度(即解离常数K值，pK值)不一，其pI值也不相同。如果将不同pI值的各种氨基酸置于同一pH值的溶液中，它们呈现不同的带电状态。在实验研究中，可借这一性质，应用离子交换层析或电泳法将不同氨基酸进行分离。第一章蛋白质的结构和功能1.2.2氨基酸的化学反应

氨基酸分子中的氨基和羧基分别具有胺和羧酸的基本反应性质。氨基如同伯胺一样，可以与酰卤、酸酐、甲醛、亚硝酸等反应，形成相应的酰胺、亚胺结构或产生氮气；羧基可以酯化和脱羧等；由于氨基与羧基同在一个分子上，它们相互影响，又呈现一些特殊的反应。此外，氨基酸侧链的某些功能基团，如羧基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基以及硫甲基等，都可以和多种试剂发生反应。所有这些氨基酸反应是人工合成多肽和蛋白质、蛋白质化学修饰或是蛋白质和氨基酸分析定量的基础，具有十分重要的实际应用价值。

第一章蛋白质的结构和功能(1)酰化反应氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生反应，氨基即被酰基化。例如与苄氧甲酰氯(carbobenzyloxychloride，cbz-Cl)反应，反应式如下：氨基酸氨基中的一个氢原子被苄氧甲酰基(cbz)取代，生成cbz-氨基酸。这是化学合成多肽时一个重要的氨基保护反应。氨基酸的α-氨基被保护后，其羧基可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，反应式如下：此反应可使氨基酸的羧基活化，使之容易与另一氨基酸的氨基结合，因此常用于多肽化学合成。第一章蛋白质的结构和功能

另一酰化试剂是丹磺酰氯(dansylchloride，DNS-Cl)，它与氨基酸的氨基反应生成DNS-氨基酸，反应式如下：

反应生成的DNS-氨基酸在紫外光下产生强烈的黄色荧光，有很高的灵敏度。因此该反应被用于多肽链氨基末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。第一章蛋白质的结构和功能(2)烃基化反应

氨基酸氨基的一个氢原子被烃基取代。例如与2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)反应。该反应是氨基酸的α-氨基与DNFB在碱性溶液中反应，生成黄色的二硝基苯基氨基酸(DNP-氨基酸)。常用于鉴定多肽或蛋白质的氨基末端氨基酸（N-端）。反应式如下：弱碱性(pH8～9)、暗处、室温或40℃条件下

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另一个烃基化反应是氨基酸的α-氨基与苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate，PITC)在弱碱性条件下反应，形成相应的苯氨基硫甲酰(phenylthiocarbamyl，PTC)衍生物。后者在硝基甲烷中与酸作用，环化生成相应的苯乙内酰硫脲(phenylthiohydantoin，PTH)衍生物。该反应多用于鉴定多肽及蛋白质的氨基末端氨基酸，在蛋白质及多肽氨基酸序列分析中占有重要地位。第一章蛋白质的结构和功能(3)甲醛反应

氨基酸与甲醛反应生成二羟甲基氨基酸。反应中使氨基酸的氨基被封闭，使羧基的酸性增强，可用强碱滴定之。此反应是用中和法测定氨基酸含量的依据，称甲酸滴定法。

氨基酸既是酸又是碱，但不能直接用酸碱滴定法来测定其含量，因为它的酸碱滴定的等当点pH过高或过低，没有适当的指示剂可用。如氨基酸的α-氨基的pK值为9.7左右，完全解离时，pH可达11或更高。在室温和pH中性条件下，甲醛与氨基酸的α-氨基结合，生成羟甲基衍生物(H+一次放出)，从而降低了氨基的碱性。可选择酚酞指示剂(变色范围8.2～10)，用氢氧化钠滴定放出的H+，因为每放出一个H+，就相当于有一个氨基氮，从氨基氮量可算出氨基酸的量。第一章蛋白质的结构和功能(4)茚三酮反应茚三酮(ninhyrin)在弱酸性溶液(pH5~7)中与α-氨基酸共热(80~100ºC)，水合茚三酮与氨基酸缩合，经脱羧脱水产生亚胺

，再经水解得到醛和氨基茚三酮，最后另一分子水合茚三酮与反应产物——氨基茚三酮缩合，生成紫红色产物。

茚三酮反应可用来鉴定与定量测定氨基酸，所有的α-氨基酸除脯氨酸外，都可显紫红色反应。谷氨酰胺和天门冬酰胺与茚三酮的反应产生棕红色化合物。第一章蛋白质的结构和功能1.2.3氨基酸的紫外吸收

组成蛋白质的20种氨基酸中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸因为它们的侧链基团含有苯环共轭双键结构，因此在紫外光区域(220～300nm)均有光吸收。酪氨酸的最大光吸收波长(λmax)在275nm，其摩尔消光系数ε275=1.4×103；苯丙氨酸的λmax为257nm，ε275=2.0×102；色氨酸的λmax为280nm，ε280=5.6×103。蛋白质多数含有这一类芳香族氨基酸，因此也具有紫外吸收能力，其最大吸收峰位于280nm。利用特定波长的紫外吸收性质，可用于蛋白质的定量分析。但不同蛋白质由于芳香族氨基酸含量不同，它们的摩尔消光系数不完全相同。因此，根据蛋白质溶液在280nm的吸光度(A280)换算溶液中蛋白质浓度，只是一个近似值。第一章蛋白质的结构和功能2蛋白质的分子结构

2.1肽与肽键

2.1.1肽键与肽单元

许多实验研究早已证明，蛋白质中氨基酸之间连接的基本方式是肽键(peptidebond)。肽键是由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基脱去1个分子水，缩合形成的共价键，属一种酰胺键。许多α-氨基酸借助肽键彼此连接形成的化合物称为肽(peptide)或肽链(peptidechain)。

肽键侧链肽单元第一章蛋白质的结构和功能

肽主链骨架实际上是由许多重复单位，即肽单元借助α-碳原子互相连接而成的。

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肽键如同一般的酰胺键一样，由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，呈现高度稳定性。共振发生在以下两种形式的肽键结构之间：

在肽键1中，C-N键是单键，氮原子上的孤对电子与羰基碳之间没有电子云重叠，羰基碳是sp2杂化，而酰胺氮是sp3杂化。在肽键2中，羰基碳和酰胺氮之间是双键，氮原子带一正电荷，羰基氧带一负电荷，羰基碳和酰胺氮都是sp2杂化，两者都呈平面，即所有6个原子都处在同一平面上。肽键的实际结构是一个共振杂化体，是介于肽键结构1与2之间的平均中间态。第一章蛋白质的结构和功能

由于肽键是一个共振杂化体，其C=N的键长为0.132nm，介于单键(C-N键长0.148nm)和双键(C=N键长0.127nm)之问。因此C-N键具有双键性质，C-N键中的C及N不易绕键旋转，于是使肽单元处于刚性平面简称肽键平面结构状态。肽键的平面性质在肽键折叠成三维构象的过程中起着极为重要的作用。

第一章蛋白质的结构和功能2.1.2肽链

肽链中的氨基酸，因为与前后相连的氨基酸形成肽键，它们每一个分子均少2个氢原子和1个氧原子，故称为氨基酸残基(aminoacidresidue)。第一章蛋白质的结构和功能

最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。含有3个、4个、5个氨基酸的肽，分别称为三肽、四肽、五肽等。一般把小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，而大于10个或10个以上氨基酸组成的肽称为聚肽或多肽。肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的，规定从肽链的－NH2末端氨基酸残基开始，称为某氨基酰、某氨基酰…某氨基酸。例如由丙氨酸残基、酪氨酸残基和谷氨酸残基组成的三肽(Ala—Tyr—Glu)，称为丙氨酰酪氨酰谷氨酸。在书写肽链结构时，通常把－NH2末端的氨基酸残基写在左边，－COOH末端氨基酸残基写在右边。第一章蛋白质的结构和功能

肽链结构所首先具有最重要的一个特点是不对称性，或称方向性。首先这种不对称性主要表现在两方面：一是任何开链肽，只有一个游离的α-NH2端，称氨基末端或N端，位于肽链的左端；一个游离的α-COOH端，称为羧基末端或C端，位于肽链的右端；二是肽链中氨基酸残基的排列顺序，不同的肽具有不同的氨基酸组成和序列，这是构成蛋白质结构多样性的基础。其次，由于组成肽链的氨基酸不同，不同的氨基酸侧链基团具有不同的解离性质，故不同的肽也呈现不同的解离行为，在溶液中表现出不同的荷电性质。再次是不同的侧链结构和性质可直接影响肽链在三维空间上的构象。第一章蛋白质的结构和功能2.1.2天然活性肽

肽链是构成蛋白质分子的基础。蛋白质肽全是无分支的开链多肽。在生物体内还有一些游离存在的肽，它们各具有不同的生物学活性，通常称为活性肽。如一些肽类激素(催产素、加压素、抗利尿激素等)、抗生素(短杆菌肽S、放线菌素D、粘菌素E等)、肽类毒素以及其他具有重要生理作用的活性小肽等。第一章蛋白质的结构和功能

自然界中存在的肽有开链式和环状结构。在游离存在的活性肽中，有的在结构上与蛋白质肽有着显著区别。如某些蕈类产生的肽类毒素——α-鹅膏蕈碱(α-amanitill)，是一个环状八肽，能抑制真核生物RNA聚合酶活性，从而抑制核糖核酸（RNA）的合成，导致机体死亡。再如在微生物中常见的环状肽短杆菌肽S，对革兰式阳性细菌有强大的抑制作用。第一章蛋白质的结构和功能

人和其他动物细胞内存在的谷胱甘肽(glutathione)，即γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，分子中的谷氨酸以其γ-羧基与半胱氨酸的α-氨基形成肽键，它在细胞中可参与可逆的氧化还原反应。第一章蛋白质的结构和功能2.2蛋白质的一级结构

由氨基酸首尾共价相连而生成的肽链是蛋白质分子的结构基础，所有的蛋白质都是在此基础上进一步构造而成的。可以想象，由众多数目的氨基酸组成，由各种不同排列的氨基酸顺序，而且还将在三维空间上进行构造，最终形成的蛋白质分子的结构是非常复杂的。要研究和剖析这类大分子化合物的结构

，必须在方法学和策略上加以合理的设计。

长期以来，生物化学家们一直采用4个不同的结构层次来分析和描述蛋白质分子的结构状态，即一级结构、二级结构、三级结构及四级结构。

所谓蛋白质分子是指具有完整生物学功能的蛋白质的最小单位。有的蛋白质分子，如肌红蛋白、溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶、羧肽酶A、木瓜蛋白酶等，仅由1条具有三级结构的肽链所构成；有的蛋白质分于，如血红蛋白、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、磷酸甘油醛脱氢酶等，是由多条具三级结构的肽链相互聚合而成，这些蛋白质就是属于四级结构的蛋白质分子。第一章蛋白质的结构和功能1952年，丹麦生物化学家Linderstrom-Lang把蛋白质的分子结构划分为三个不同的组织层次（level,hierarchy）：一级结构（primarystructure）：指多肽链中氨基酸残基的数目、组成及其排列顺序（N-端→C-端），即由共价键维系的多肽链的二维（线性）结构，不涉及空间排列。二级结构（secondarystructure）：是多肽链主链（backbone）在氢键等次级键作用下折叠成的构象单元或局部空间结构，未考虑侧链的构象和整个肽链的空间排布。三级结构（tertiarystructure）：则指整个肽链的氨基酸残基侧链基团互相作用以及与环境间的相互作用下形成的三维结构。1958年英国晶体学家Bernal发现寡聚蛋白由具有三级结构的亚基在次级键作用下结合而成，遂把寡聚体内亚基的空间排列称为四级结构（quaternarystructure）。第一章蛋白质的结构和功能

上述蛋白质分子一、二、三、四级结构的概念已被国际生物化学与分子生物学学会命名委员会正式采纳和定义。60年代以后，随着对蛋白质分子结构知识的积累，又增加了不少新的内容。如在三级结构以上又增加了四级结构，在二级和三级结构之间又增加了超二级结构和结构域这两个结构层次。

1973年Rossman发现相邻的二级结构往往形成某种有规律的、空间上可辩认的、更高层次的折叠单元，称为超二级结构（super-secondarystructure）或折叠单元（foldingunit），主要涉及这些构象元件在空间上如何聚集。与此同时，Wetlaufer观察到蛋白质分子中存在相对稳定的球状亚结构，其间由单肽链相互连接，命名为结构域（structuraldomain）。第一章蛋白质的结构和功能蛋白质分子的结构层次：A、一级结构，B、二级结构，C、结构域，D、三级结构，E、四级结构，F、大分子子组合体第一章蛋白质的结构和功能球状蛋白分子结构的不同水平图中A代表组成一级结构的各种氨基酸；S和sS分别代表蛋白质中的二级结构和由它们组合成的超二级结构；D/T表示蛋白质的结构域，如果是单结构域的蛋白质，此结构域即蛋白质的三级结构；同样，T/α表示由结构域构成的蛋白质的三级结构或亚基；Q代表蛋白质的四级结构，可以是n个相同亚基α装配成的同源聚集体，也可以是n个α亚基和m个β亚基（甚至更多种亚基）形成的异源聚集体。第一章蛋白质的结构和功能

天然蛋白质都具有独特而稳定的三维结构，即构象(conformation)。构象是指分子内各原子或基团之间的相互立体关系。构象的改变是由于单键的旋转而产生的，不需有共价键的变化(断裂或形成)，但涉及到氢键等次级键的改变。1969年国际纯化学和应用化学联合会(IUPAC)规定在描述蛋白质等生物大分子的空间结构时应使用构象一词。按照这种划分，二级结构以上的结构都属于构象的范畴。

构型(configturation)，是指在立体异构体中，取代基团或原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置所形成的不同立体结构。构型的改变必须有共价键的断裂。如几何(顺反)异构体中，取代基团因受双键的限制，而有顺式和反式两种构型；在光学异构体中，a碳原子上的四个基团不同，只可能取两种不同的空间排布，这两种不同的空间排布称为不同的构型。第一章蛋白质的结构和功能2.2.1蛋白质一级结构

蛋白质的一级结构(primarystructure)又称为共价结构、化学结构。不同的蛋白质都具有特定的构象，但从一级结构来看，蛋白质是由许多的氨基酸按照一定的排列顺序，通过肽键相互连接起来的多肽链结构。1969年，IUPAC曾规定蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸排列顺序和连接方式。它是蛋白质分子结构的基础，包含了决定蛋白质分子所有结构层次构象的全部信息。如果蛋白质分子中存在二硫键，一级结构也包括形成二硫键的半胱氨酸残基的位置。一级结构即氨基酸序列是区别不同蛋白质最基本、最重要的标志。一级结构决定了蛋白质的三维空间构象。第一章蛋白质的结构和功能

胰岛素(insulin)是由人和其他哺乳动物胰岛β-细胞合成释放的蛋白质激素，具有促进葡萄糖氧化利用和转变成糖原储存，降低血葡萄糖浓度的作用，是调节糖、脂类和蛋白质代谢的重要激素。胰岛素分子的一级结构由A链和B链两条肽链组成，其中A链含21个氨基酸，N端为甘氨酸、C端为天冬酰胺；B链含30个氨基酸，N端为苯丙氨酸，C端为丙氨酸。整个分子含有3个二硫键，其中1个位于A链内，2个位于A、B链之间。第一章蛋白质的结构和功能

多肽链可取3种不同的一级结构形式，即无支链开链多肽、分支开链多肽和环状多肽。某些天然多肽种含有蛋白质中不常见的或不存在的氨基酸，如β-氨基酸、D型氨基酸等，这些结构上的变化可能起保护这些多肽免受蛋白水解酶降解的作用。

第一章蛋白质的结构和功能2.2.2蛋白质一级结构研究进展

蛋白质的一级结构即多肽链中氨基酸残基的排列顺序（N-端→C-端）是由基因编码的，是蛋白质高级结构的基础，因此一级结构的测定成为十分重要的基础研究。

1945～1955年，英国生物化学家Sanger率先完成了人胰岛素的序列测定，从而揭开了蛋白质一级结构研究的序幕。

1950年，瑞典科学家Edman发明了以他的名字命名的N-端测定法，并与Begg在1967年发明了序列仪，极大地推动了蛋白质一级结构的测定工作。尽管如此，蛋白质一级结构测定仍是一项相当耗费时间和资金的工作。因而测序方法和技术的改进与创新势在必行。。第一章蛋白质的结构和功能一级结构测定的基本方法有如下几种：1、获取一定量纯的蛋白质样品，且分子量已知：将一部分样品完全水解，确定该蛋白中的氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。

2、进行末端分析确定该种蛋白质的肽链数目，N-端和C-端各是什么氨基酸。

(1)N-末端分析①2,4-二硝基氟苯（FDNB）法②Edman降解法③5-二甲氨基萘-1-磺酰氯法（丹磺酰氯法，DNS）

(2)C-末端分析

①肼解法（NH2NH2）②羧肽酶法(Carboxypeptidasemethod，CPE法)

第一章蛋白质的结构和功能

3、肽链的拆分经末端分析，若该种蛋白质有两条以上的肽链组成时应将其拆分开。如果肽链之间通过非共价键连接，可使用一切使蛋白质变性的试剂。如果肽链之间通过共价键相连(主要是二硫键)，可采用过甲酸氧化或巯基乙醇还原的方法。

4、肽链中氨基酸排列顺序的确定一般使用片段重叠法。一些专一性的蛋白水解酶或化学试剂，能使蛋白质的多肽链在特定的部位断裂，产生一些大小不同的重叠片段，分离纯化这些肽段，测定每一个肽段的氨基酸顺序，根据这些重叠的片段，推断出完整肽链的氨基酸排列顺序。

第一章蛋白质的结构和功能常用的断裂多肽链的方法有以下几个：①溴化氰(CNBr)裂解法：它专一性水解甲硫氨酸的羧基形成的肽键。溴化氰水解的结果产生以高丝氨酸内酯结尾的肽，高丝氨酸内酯是甲硫氨酸转变来的。②胰蛋白酶水解法：胰蛋白酶专一性水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键。但是，如果赖氨酸和精氨酸的羧基与脯氨酸相连，则该酶不能作用。第一章蛋白质的结构和功能常用的断裂多肽链的方法有以下几个：③胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)水解法：它专一性水解疏水性氨基酸，主要是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的羧基形成的肽键。若与它们的羧基相连的氨基酸为脯氨酸，该酶不能水解。④胃蛋白酶水解法：它要求断裂键两侧的氨基酸都是疏水性的氨基酸。⑤金黄色葡萄球菌蛋白酶(谷氨酸蛋白酶)水解法：它专一性水解谷氨酸和天门冬氨酸的羧基形成的肽键。⑥梭状芽孢杆菌蛋白酶(精氨酸蛋白酶)水解法：它能水解精氨酸的羧基形成的肽键。第一章蛋白质的结构和功能

5、分离纯化部分降解的肽片段分析每一片段的氨基酸组成和排列顺序。

6、确定二硫键的位置。

7、根据重叠肽的氨基酸顺序，推出