第二章 可见-紫外分光光度法

仪器分析InstrumentalAnalysis第二章可见-紫外分光光度法第二章光谱分析法概论主讲教师高金波第二章可见-紫外分光光度法本章主要介绍:光学分析法定义光学分析的三个主要过程电磁辐射和电磁波谱电磁辐射与物质的相互作用光学分析法的分类第二章可见-紫外分光光度法

基于物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用后产生的辐射信号或发生的信号变化来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分析法。一、定义（光学分析法）第二章可见-紫外分光光度法1.

能源（光源）提供能量2.能量与物质相互作用3.产生被检测的信号二、光学分析的三个主要过程第二章可见-紫外分光光度法1.电磁辐射—电磁波（光是其中的一部分）

它是一种以极高的速度传播的光子流在传播过程中不需要任何的物质作为传播媒介

它具有波动性和粒子性。三、电磁辐射和电磁波谱第二章可见-紫外分光光度法(1)波动性表现在:

每种电磁辐射都有确定不变的频率(2)粒子性表现在:

每个粒子都具有能量E第二章可见-紫外分光光度法2.电磁波谱:电磁辐射按波长顺序排列而成γ射线→x

射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波

高能辐射区γ射线能量最高，可以引起核能级跃迁

χ射线可以引起内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光可以引起原子和分子外层可见光电子能级的跃迁红外光可以引起分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波以引起原子核自旋能级的跃迁五、光学分析法分类第二章可见-紫外分光光度法四、电磁辐射与物质的相互作用五、光学分析法分类第二章可见-紫外分光光度法光学分析法光谱分析法非光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原子吸收光谱原子发射光谱原子荧光光谱X射线荧光光谱折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法第二章可见-紫外分光光度法光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光第二章可见-紫外分光光度法第十章可见-紫外吸收光度法可见光区和紫外光区的划分:200~400nm为紫外光区400~760nm为可见光区可见紫外分光光度法的定义根据物质的分子对200~760nm这一光区电磁辐射的吸收特性进行的物质成分分析与分子结构分析的方法第二章可见-紫外分光光度法第一节紫外-可见分光光度法

的基本原理和概念转动能级差0.005~0.05V振动能级差0.05~1eV外层价电子能级差1~20eV电子光谱250~25m25000~1250nm1250~60nm吸收光谱分子光谱第二章可见-紫外分光光度法一、电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的化合物或基团

π电子→不饱和的化合物或基团

n电子→含有杂质原子的基团轨道：电子围绕原子或分子运动的几率

轨道不同，电子所具有能量不同第二章可见-紫外分光光度法图示b1SH1SH*

成键轨道与反键轨道：第二章可见-紫外分光光度法

一、电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.π→π*跃迁：不饱和基团（C＝C，C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大第二章可见-紫外分光光度法一、电子跃迁类型：3.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（C≡NC＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）4.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2

，—X，—S）E较大，λ150~250nm按能量大小：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*第二章可见-紫外分光光度法续前结论：紫外光谱电子跃迁类型：n→π*跃迁

π→π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）第二章可见-紫外分光光度法二、紫外-可见法相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同

以波长λ—吸光度A作图，所描绘的曲线为~2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λ最大吸收谷→λ最小肩峰→λsh

末端吸收→靠近200nm的呈现第二章可见-紫外分光光度法图示第二章可见-紫外分光光度法3．生色团（发色团）：

能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁

E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—，

—NO2等第二章可见-紫外分光光度法续前本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强，同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH2，—SR，—X4．助色团第二章可见-紫外分光光度法续前5．红移和蓝移：

由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）第二章可见-紫外分光光度法续前6．增色效应和减色效应

结构发生变化时

增色效应：吸收强度增强的效应

减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：

ε>104→强带

ε<102→弱带第二章可见-紫外分光光度法三、吸收带类型和分子结构的关系1．R带：由含杂原子的不饱和基团的

n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—，—NO,—NO2特点：E小，λmax250~400nm，ε最大<100溶剂极性↑，λ最大↓→蓝移（短移）吸收峰的位置第二章可见-紫外分光光度法三、吸收带类型和分子结构的关系2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生特点：λ最大>200nm，ε最大>104(—CH＝CH—)n

，—CH＝C—CO—共轭体系增长，λ最大↑→红移，ε最大↑溶剂极性↑，λ最大↑→红移第二章可见-紫外分光光度法续前3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带λ最大

=254nm，宽带，具有精细结构；ε最大=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失三、吸收带类型和分子结构的关系精细结构第二章可见-紫外分光光度法图示第二章可见-紫外分光光度法续前4．E带：由苯环的环形共轭系统中的π→π*跃迁产生的芳香族化合物的特征吸收带

见图E1180nmε最大>104（常观察不到）E2200nmε最大=7000强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2

带与K带合并一起红移（长移）。三、吸收带类型和分子结构的关系第二章可见-紫外分光光度法图示第二章可见-紫外分光光度法图示第二章可见-紫外分光光度法*下列化合物K带的吸收波长最大的是：A：H2C=CH-CH=CH2

；B：H2C=CH2；C：H2C=CH-CH=CH-CH=CH2；D：H2C=CH-C=OR带是由_________跃迁引起，其特征是波长_______。K带是由_________跃迁引起，其特征是波长_______。*丙酮能吸收280nm，187nm和154nm的紫外光，其中最长波长的吸收所对应的电子跃迁类型为___，该吸收带为___带。*符合比耳定律的有色溶液稀释时，其吸收曲线的最大吸收峰

A．上移；B．下移；C．左移；D．右移*在分光光度法中，吸收曲线指的是：A.A一c曲线；B.A一λ曲线；C.T一c曲线；D.A一T曲线练习：第二章可见-紫外分光光度法续前1．溶剂效应：对λ最大影响：

n-π*跃迁：溶剂极性↑，λ最大↓蓝移π-π*跃迁：溶剂极性↑，λ最大↑红移见图解对吸收光谱精细结构影响

溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λ最大2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长四、影响吸收带位置的因素：第二章可见-紫外分光光度法图示跃迁类型 正己烷氯仿 甲醇 水

→

*230 238 237 243n→

* 329 315 309 305第二章可见-紫外分光光度法五、郎伯比尔定律假设一束平行单色光通过一个吸光物体（一）lambert-beer第二章可见-紫外分光光度法1．Lamber-beer定律的适用条件（前提）

入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性

应用：多组分测定讨论：第二章可见-紫外分光光度法

讨论:4.C与A的关系(成正比关系)

C=C0，A=A0

；C=2C0，A=2A0；

C=1/2C0

，A=1/2A0

；5.C与T的关系(指数关系)C=C0

，T=T0

；C=2C0，T=T02

；

C=1/2C0，T=T01/2=

；第二章可见-紫外分光光度法(二)吸光系数****1.物理意义：

λ一定，单位浓度、单位厚度的吸光度

讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质,温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收-）同一物质在不同波长下,E

一定不同3）

E↑，物质对光吸收能力↑,测定灵敏度↑4）定性、定量依据第二章可见-紫外分光光度法续前2．两种表示法：

1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度

2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度

3）两者关系3.吸光系数能否直接测得？不能？？第二章可见-紫外分光光度法六、偏离比尔定律的因素（一）化学因素（二）光学因素

1.非单色光

2.非平行光

3.杂散光

4.散射和反射的影响第二章可见-紫外分光光度法（一）化学因素Beer定律适用的另一个前提——稀溶液因浓度的改变使C与A关系偏离Beer定律离解、聚合（缔合）、与溶剂作用第二章可见-紫外分光光度法（二）光学因素1．非单色光的影响非单色光是指含有二种或两种以上波长的光第二章可见-紫外分光光度法续前第二章可见-紫外分光光度法续前讨论：

入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状为什么测定波长常选择在吸收峰处？E1>E2，A值减少，产生负误差;E2>E1，A值增大，产生误差第二章可见-紫外分光光度法续前2．杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：比色池要垂直放置，不同仪器测定A值不同。第二章可见-紫外分光光度法四、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音

1）暗噪音

2）讯号噪音第二章可见-紫外分光光度法续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关与光讯号无关第二章可见-紫外分光光度法续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测定有利第二章可见-紫外分光光度法第二节可见-紫外分光光度计分光光度计构成的主要部件分光光度计的类型：第二章可见-紫外分光光度法第二节紫外-可见分光光度计光路示意图0.575光源单色器吸收池检测器放大显示器第二章可见-紫外分光光度法第二节紫外-可见分光光度计一、主要部件1.光源：用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有热辐射光源

(钨灯)和气体放电光源

(氢灯)两类。。（1）钨灯或卤钨灯

在350nm~2500nm连续用于可见光区（2）氢灯或氘灯

在150nm~400nm连续用于紫外光区配稳压器配稳流器第二章可见-紫外分光光度法第二节紫外-可见分光光度计2.单色器：单色器是把复合光分散后，能获得单色光的装置。

五个部分作用：将光源发出的复色光按波长顺序分离成单色光。组成：狭缝2、准直镜2、色散元件(棱镜、光栅)。第二章可见-紫外分光光度法单色器光路示意图入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400单色器的核心部分是色散元件，起分光的作用。第二章可见-紫外分光光度法单色器光路示意图第二章可见-紫外分光光度法3．吸收池：玻璃——能吸收紫外线光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）第二章可见-紫外分光光度法4．检测器：将光信号转变为电信号的装置光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器5．记录装置：讯号处理和显示系统第二章可见-紫外分光光度法

1、光电池：用半导体材料制成的，用得最多的是硒光电池。其结构和作用原理为：硒光电池第二章可见-紫外分光光度法光电管：它是在抽成真空或充有惰性气体的玻璃或石英泡内装上2个电极构成，其结构如图：2.光电管1234第二章可见-紫外分光光度法红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm光电管第二章可见-紫外分光光度法光电倍增管：它是一个非常灵敏的光电器件，可以把微弱的光转换成电流其灵敏度比前2种都要高得多。它是利用九次电子发射以放大光电流，3.光电倍增管：第二章可见-紫外分光光度法光电倍增管1个光电子可产生106

～107

个电子第二章可见-紫外分光光度法讯号处理及显示系统放大器表头显示荧屏显示数字显示第二章可见-紫外分光光度法二、分光光度计的类型：第二章可见-紫外分光光度法二、分光光度计的类型：（一）单光束分光光度计：0.575光源单色器吸收池检测器显示第二章可见-紫外分光光度法特点：使用时来回拉动吸收池

→移动误差对光源要求高比色池配对单光束分光光度计（751）：第二章可见-紫外分光光度法（二）单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器第二章可见-紫外分光光度法双光束分光光度计：特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱第二章可见-紫外分光光度法光源单色器单色器检测器切光器狭缝吸收池（三）双光束双波长分光光度计：第二章可见-紫外分光光度法3．双波长分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差第二章可见-紫外分光光度法第三节紫外-可见分光光度分析方法一、定性分析二、纯度检测三、单组份的定量分析****四、多组分的定量分析-同时测定法*五、结构分析六、比色分析法*第二章可见-紫外分光光度法一、定性分析定性鉴别的依据→吸收光谱吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度（相应的吸光系数）第二章可见-紫外分光光度法续前1．对比吸收光谱的特征值第二章可见-紫外分光光度法续前2．对比吸光度或吸光系数的比值例：第二章可见-紫外分光光度法续前3．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较第二章可见-紫外分光光度法续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：主成分强吸收，杂质无吸收测定结果显示为弱吸收→与纯品比较，E↓

杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形第二章可见-紫外分光光度法续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算

2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05

即符合要求的杂质限量≤0.06%第二章可见-紫外分光光度法二、吸收度的测量（补充内容）1.比色皿的选择:1.玻璃;1)石英2.溶剂的选择:极限波长3.波长的选择:4.

空白对比5.测定步骤

1)本身调零;2)空白调零;3)测量样品溶液的浓度

A=0.2~0.8第二章可见-紫外分光光度法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法4．增量法三、单组分的定量方法第二章可见-紫外分光光度法续前1．吸光系数法（绝对法）第二章可见-紫外分光光度法例：维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度解：第二章可见-紫外分光光度法练习例：精密称取B12

样品25.0mg，用水溶液配成100ml，精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12

的百分含量？。解：补充系数法求含量第二章可见-紫外分光光度法续前2．标准曲线法过程：配制标准系列溶液测定各标准溶液的吸收度绘制工作曲线

C~A曲线求出方程样品溶液测定A值由方程求出浓度第二章可见-紫外分光光度法

A200240280320360400440nm2.

标准曲线法

max第二章可见-紫外分光光度法CxAxA0Concentration要求

1.r>0.9992.n=5-73.待测浓度尽量在标准曲线中间位置标准曲线(A=aC+b,r)第二章可见-紫外分光光度法续前3．对照法(外标一点法)注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时第二章可见-紫外分光光度法(三)对照法待测样品(Unknownsample)标准样品(Referencesample)第二章可见-紫外分光光度法要求-标准溶液的浓度应尽量接近样品浓度=A标A样C标C样C样=C标·A样A标第二章可见-紫外分光光度法练习例：维生素B12

的含量测定精密吸取B12

注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000毫升在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12

注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12

注射液的标示量为100μg/毫升）。第二章可见-紫外分光光度法解：

1）对照法第二章可见-紫外分光光度法练习2）吸光系数法第二章可见-紫外分光光度法续前四、多组分的定量方法

三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λ最大下不重叠→分别按单组分定量第二章可见-紫外分光光度法续前2．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→组分干扰→不能按单组分定量测Ca第二章可见-紫外分光光度法续前3．两组分吸收光谱完全重叠

——混合样品测定（1）解线性方程组法（2）等吸收点法（3）等吸收双波长消去法（4）系数倍率法第二章可见-紫外分光光度法（1）解线性方程组法步骤：第二章可见-紫外分光光度法2.等吸收点法等吸收点：两物质在某波长处的吸收系数相等，该波长为~Ca=Cb第二章可见-紫外分光光度法3．等吸收双波长法步骤：消除a的影响后测bab第二章可见-紫外分光光度法续前消去b的影响，测定a组分注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大ab第二章可见-紫外分光光度法五、有色化合物的测定方法

——光电比色法（一）显色反应和显色剂：1.显色反应：在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。第二章可见-紫外分光光度法显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是氧化还原反应。Fe3＋＋SCN－

=FeSCN2+

；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在这两类反应中，用得较多的是配位反应。第二章可见-紫外分光光度法（2）有机显色剂：1）有机显色剂的优点：A.具有鲜明的颜色，ε都很大（一般可达到104

以上），所以测定的灵敏度很高；B.生成的一般为螯合物，稳定性很好，一般离解常数都很小；2.显色剂：

（1）无机显色剂：第二章可见-紫外分光光度法C.选择性好D.有些有色配合物易溶于有机溶剂，可进行萃取光度分析，提高了测定的灵敏度和选择性。第二章可见-紫外分光光度法（3）常见的有机显色剂：1）磺基水杨酸：其结构式如下：它可用于测定三价铁离子。第二章可见-紫外分光光度法2）邻二氮菲（邻菲罗啉）：结构式为：直接在PH=3～9时与Fe2+生成红色螯合物用于铁的测定。NN第二章可见-紫外分光光度法3）双硫腙：也叫二苯-硫腙结构式为：