第十二章荧光分析法课件

荧光分析的基本原理荧光定量分析方法荧光分析仪器与技术荧光分析法荧光分析的基本原理荧光分析法荧光分析法概述光致发光：吸收某种波长的光后发射出比吸收波长更长的光的现象。荧光分析法

(fluorormetry)荧光光谱→定性分析荧光强度→定量分析荧光分析的分类分析对象激发光波长范围(荧光和磷光)原子荧光分析分子荧光分析

紫外-可见荧光分析红外荧光分析X射线荧光分析荧光分析法概述光致发光：吸收某种波长的光后发射出比吸收波长更荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别紫外光I0IA∝CF(S=10-9~10-12g/ml)样品溶液UV-vis(S=10-6~10-7g/ml)F∝C荧光分析法荧光分析法概述（续前）平行于入射光垂直于入射光优点：灵敏度高（吸收）（发射）荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别紫外光I0IA∝C荧光分析法的基本原理分子荧光的产生原理荧光物质分子的光谱特征荧光强度及其影响因素荧光分析法的基本原理分子荧光的产生原理单重态与三重态单重态(sigletstate,S)：总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1基态(S0)三重态(tripletstate,T)：

s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3激发单重态(S)激发三重态(T)单重态与三重态单重态(sigletstate,S)：基态(激发态分子返回基态的途径

振动弛豫(vibrationalrelexation)内部能量转换(internalconversion)荧光(fluorescence)发射外部能量转换(externalconversion)体系间跨越(intersystemcrossing)磷光发射激发态分子返回基态的途径振动弛豫(vibrational激发态→基态途径（图）吸收基态(S0)第二电子激发单重态(S2*)第一电子激发三重态(T1*)振动弛豫内转换荧光外转换体系间跨越磷光第一电子激发单重态(S1*)S1*(V=0)激发态→基态途径（图）吸收基态(S0)第二电子激发单重态(S振动弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非辐射~10-12s内部能量转换（内转换）激发态分子返回基态的途径（续前）S1*(V=n)S2*(V=0)非辐射E很小荧光发射

S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)内转换振动驰豫辐射荧光：物质分子接受光能激发后，从第一电子激发态最低振动能级返回基态时发射出的光。振动弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非辐射~10-12s外部能量转换（外转换）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞转移能量热平衡过程S1*(V=0)T1*(V=n)非辐射激发态分子返回基态的途径（续前）磷光发射

体系间跨越体系间跨越

S1*(V=0)振动驰豫Sn*(V=n)内转换S0(V=n)辐射T1*(V=0)（10-4~10s）T1*(V=n)振动弛豫T1*(V=n)S1*(V=0)非辐射外部能量转换（外转换）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞转移荧光和磷光的主要区别发光机制实验现象荧光磷光单重态→单重态激发光停止照射→荧光立即消失三重态→单重态激发光停止照射→磷光仍将延续一段时间荧光和磷光的主要区别发光机制实验现象荧光磷光单重态→单重态激激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长发射波长——荧光物质分子的两个特征光谱激发光谱(excitationspectrum)：

F~

ex

荧光光谱(fluorescencespectrum)：

F~

em激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长发射波长——荧光物质分子的硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱激发光谱荧光光谱硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱的特征斯托克斯位移(Stokesshift)

荧光发射波长总是大于激发光波长（能量损失）荧光光谱的形状与激发波长无关

激发：S0(V=0)→Sn*(V=n)荧光：S1*(V=0)→S0(V=n)S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)内转换振动驰豫辐射

荧光光谱的特征斯托克斯位移(Stokesshift)荧光荧光光谱与激发光谱呈镜像关系蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）荧光光谱

S0→S2*激发光谱S0→S1*激发光谱荧光光谱与激发光谱呈镜像关系蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱激发光谱：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)荧光光谱：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)

蒽的能级跃迁荧光光谱的特征（续前）激发光谱：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)蒽的能荧光寿命和荧光效率

荧光寿命(fluorescencelifttime,

f)：当激发光停止照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间。——荧光物质的两个重要发光参数指数衰减定律：Ft=F0e-Kt

(K：衰减常数)

t=

f→Ft=(1/e)F0

Ft/F0-t作图→直线斜率=1/

f→

f

=1/斜率荧光寿命和荧光效率荧光寿命(fluorescenceli荧光效率(fluorescenceefficiency)

荧光量子产率(fluorescencequantumyield)物质

f溶剂荧光素钠0.92水荧光素0.65水蒽0.30乙醇菲1.00乙醇荧光效率(fluorescenceefficiency)

物质分子能发射荧光的两个必要条件有强的紫外-可见吸收有一定的荧光效率n→

*

→

*共轭双键，K带强吸收，荧光效率高，荧光强度强。弱吸收，体系间跨越几率大，荧光较弱，意义不大。物质分子能发射荧光的两个必要条件有强的紫外-可见吸收n→有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构（芳香环、稠环或杂环）共轭系统↑→

f↑→

ex、

em↑有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构（芳香环、稠环或杂环

ex=327nm，

em=510nm稠芳环分子的几何排列对荧光的影响含有长共轭双键的脂肪烃

ex=327nm，em=510nm稠芳环分子的几何排分子的刚性和共平面性共轭系统的刚性和共平面性↑→

f↑联苯

f=0.2芴

f=1.0分子的刚性和共平面性共轭系统的刚性和共平面性↑→f↑金属离子络合增加分子刚性和共平面性8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁位阻效应和立体效应→

f↓1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐

f=0.75

f=0.03位阻效应金属离子络合增加分子刚性和共平面性取代基供电子基：

–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN

→

f

↑，F↑吸电子基：

-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X→

f

↓，F↓，甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+→对

f

无影响

取代基供电子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-C影响荧光强度的外界因素温度T↓→F↑溶剂极性↑→

f↑→F↑→↑粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓形成氢键→S1*(V=0)分子↓→F↓pH值pH<2pH7~12pH>13弱酸、弱碱兰色荧光影响荧光强度的外界因素温度T↓→F↑溶剂极性↑→f↑→F↑荧光熄灭剂荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。荧光熄灭剂(quenchingmedium)：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。荧光熄灭剂荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或引起荧光熄灭的原因碰撞→损失能量作用→不发光物质重原子Br/I→体系间跨越→三重态溶解O2→荧光物质氧化/O2顺磁性→体系间跨越→三重态荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量1

g~1mg/ml)荧光熄灭法(fluorescencequenchingmethod)：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。引起荧光熄灭的原因碰撞→损失能量荧光熄灭法(fluoresc种类瑞利光(Reyleighscatteringlight)：弹性碰撞，不发生能量交换，仅改变光子运动方向，波长及频率不变。拉曼光(Ramanscatteringlight)：非弹性碰撞，发生能量交换，光子的运动方向和波长、频率均发生改变。较长拉曼光干扰荧光测定。散射光散射光(scatteringlight)：由于光子与物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。种类较长拉曼光干扰荧光测定。散射光散射光(scatterin硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)荧光光谱拉曼光谱瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm荧光448nm激发320nm激发350nm瑞利光350nm硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)荧光光谱荧光定量分析荧光定量分析的依据——F与C的关系荧光定量分析方法荧光分析法与UV-vis定量分析的区别荧光定量分析荧光定量分析的依据——F与C的关系荧光强度F与浓度C的关系溶液的荧光测定激发光源垂直方向荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。F=K

(I0–I)

(I=I010-ECl)

=K

(I0-I010-ECl)=K

I0(1-10-ECl)=K

I0(1-e-2.3ECl)太劳极数展开式：ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+……

荧光强度F与浓度C的关系溶液的荧光测定激发光源垂直方向荧光测ECl≤0.05F=2.3K

I0ECl=KC荧光分析法仅适用于稀溶液的测定满足定量分析条件：ECl≤0.05→F∝C降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用灵敏度高（放大信号）F与C的关系推导（续前）荧光定量分析的依据

ECl≤0.05F=2.3KI0ECl=KC荧光分析法仅荧光分析法与UV-vis灵敏度差异紫外-可见分光光度法定量依据：A∝C

检测信号：A=-lg(I/I0)=ECl

C↓→I0/I≈1→A≈0

荧光分析法定量依据：F∝I0及C

检测信号：F=2.3K

I0ECl

C↓→F↓→放大信号（检测灵敏度↑）→I0↑→F↑→荧光分析灵敏度高→放大信号→I0↑，I↑→I/I0不变→UV-vis灵敏度受限，不如荧光分析(S=10-6~10-7g/ml)(S=10-9~10-12g/ml)

荧光分析法与UV-vis灵敏度差异紫外-可见分光光度法定量依荧光定量分析方法校正曲线法(F~C)

荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别0100%UV-vis荧光分析法T=0，A=∞关闭光闸，光不透过，全吸收T=100%，A=0空白溶液，光全透过，不吸收F=0空白溶液，不发射荧光F=100%对照品溶液CmaxF=50%(Cmid)荧光定量分析方法校正曲线法(F~C)荧光分析法与UV-vi比例法荧光定量分析方法（续前）适用：校正曲线过原点多组分混合物测定

原理：荧光强度的加和性方法：解联立方程空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零→F0→Fs和Fx→扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)计算。比例法荧光定量分析方法（续前）适用：校正曲线过原点多组分混合荧光分析仪器与技术荧光分析仪器类型、主要部件和校正荧光分析新技术荧光分析的应用荧光分析仪器与技术荧光分析仪器类型、主要部件和校正荧光分析仪器类型滤光片荧光计分光系统：激发滤光片（带通型）发射滤光片（截止型）用途：可用于定量分析；不能测定光谱滤光片-单色器荧光计分光系统：激发滤光片+发射光栅用途：可用于测定荧光光谱及定量分析；不能测定激发光谱，

荧光分析仪器类型滤光片荧光计滤光片-单色器荧光计930型荧光计光路示意图激发滤光片发射滤光片荧光分析仪器类型（续前）

930型荧光计光路示意图激发滤光片发射滤光片荧光分析仪器类型荧光分光光度计荧光分光光度计结构示意图分光系统：光栅用途：测定激发光谱、荧光光谱及定量分析。最大激发波长

exmax和最大荧光波长

emmax是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。激发单色器发射单色器荧光分析仪器类型（续前）荧光分光光度计荧光分光光度计结构示意图分光系统：光栅最大激发荧光分析仪器的主要部件激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯分光系统：滤光片；单色器（光栅）样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光检测器：紫外-可见（光电倍增管）荧光分析仪器的主要部件激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯荧光分析仪器的校正灵敏度校正：对照品溶液Cmax→F=100%

Cmid→F=50%

硫酸喹啉:0.001g喹啉标准品→硫酸(0.05mol/L)→C=1

g/ml波长校正：汞灯标准谱线激发光谱与荧光光谱的校正单光束：调整光源强度一致双光束：参比光束抵消光学误差荧光分析仪器的校正灵敏度校正：对照品溶液Cmax→F=10荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别

紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路光源仪器校正吸收池入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别紫外-可见分光光度计荧荧光分析新技术激光荧光分析时间分辨荧光分析(time-resolvedfluorometry)原理：激发和检测之间延缓一段时间，具有不同荧光寿命的物质分别检测激发光源：脉冲激光优点：检测时排除干扰，无需化学预处理激发光源：波长更短、强度更大的激光优点：提高灵敏度(样品量<1

l或10-16~10-14g)和专一性用途：生化样品、气体样品及有机化合物的自由基荧光分析新技术激光荧光分析时间分辨荧光分析(time-res同步荧光分析原理：

=

exmax-

emmax→同步荧光光谱→

同步信号Fsp(

ex,

em)=KCFexFem用途：多核芳香族化合物荧光分析新技术（续前）胶束增敏荧光分析原理：胶束溶液的增溶、增稳、增敏作用优点：提高荧光物质溶解度、稳定性及灵敏度胶束溶液：一定浓度(>临界胶束浓度CMC)的表面活性剂溶液亲水基疏水基同步荧光分析原理：=exmax-emmax→同步荧光荧光分析的应用有机化合物的荧光分析研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物有机化合物：多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质药物：生物碱类(麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱)；甾体类(皮质激素及雌醇)；抗生素类(青霉素、四环素)；维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺)中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）荧光分析的应用有机化合物的荧光分析研究对象：芳香族及具有芳香荧光试剂荧光胺荧光条件：

ex=275