结构生物学介绍和进展课件

结构生物学董宇辉BSRF，IHEP，CAS结构生物学董宇辉1结构生物学的定义顾名思义，结构生物学就是研究各种生物大分子（蛋白质、核酸、糖类等）的结构，结构与功能的关系，以及如何在生物体内发挥作用的学科。结构生物学的定义顾名思义，结构生物学就是研究各种生物大分子（2结构的重要性生物大分子的功能主要取决于其结构。结构的异常会引起功能的改变，也是所谓“构像病”的原因。结构的重要性生物大分子的功能主要取决于其结构。3疯牛病等构像病的罪魁祸首—Prion正常的Prion致病的Prion由于结构的变化，导致了疯牛病、克雅氏病（Creutzfeldt-JacobDisease；CJD）等传染性脑海绵状病变（TSE）。疯牛病等构像病的罪魁祸首—Prion正常的Prion致病的P4分子生物学：

现代生物学的主流方向分子生物学是现代生物学中最重要的学科，几乎每年的诺贝尔化学奖，生理学或医学奖都授予这方面的研究。研究各种生物大分子的功能以及在生物体中的生物化学过程，是分子生物学最重要的任务。分子生物学：

现代生物学的主流方向分子生物学是现代生物学中最5结构在现代生物学里的中心地位在分子生物学中，结构是非常重要的内容。只有在获得相应分子的结构后才能深入地研究其功能和生化过程。结构在现代生物学里的中心地位在分子生物学中，结构是非常重要的6举例酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的结构以及如何与底物的结合后，才能真正了解这种酶的作用机理；对肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白的结构有了详细的了解，才能说明肌肉收缩和非肌肉细胞运动的机理。举例酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的结构以及如何与底物的结7NobelinStructure一共有11项诺贝尔奖授予生物分子结构方面的研究。有结构解析方法研究，也有重要的生物分子结构和功能研究的工作。NobelinStructure一共有11项诺贝尔奖授予8TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962FrancisHarryComptonCrickJamesDeweyWatsonMauriceHughFrederickWilkins"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinPhysiology9TheNobelPrizeinChemistry1962MaxFerdinandPerutzJohnCowderyKendrew"fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry110TheNobelPrizeinChemistry1964DorothyCrowfootHodgkin"forherdeterminationsbyX-raytechniquesofthestructuresofimportantbiochemicalsubstances"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry111TheNobelPrizeinChemistry1982AaronKlug"forhisdevelopmentofcrystallographicelectronmicroscopyandhisstructuralelucidationofbiologicallyimportantnucleicacid-proteincomplexes"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry112TheNobelPrizeinChemistry1985HerbertA.HauptmanJeromeKarle"fortheiroutstandingachievementsinthedevelopmentofdirectmethodsforthedeterminationofcrystalstructures"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry113TheNobelPrizeinChemistry1988"forthedeterminationofthethree-dimensionalstructureofaphotosyntheticreactioncentre"JohannDeisenhoferRobertHuberHartmutMichelFrom/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry114TheNobelPrizeinChemistry1997PaulD.BoyerJohnE.WalkerJensC.Skou"fortheirelucidationoftheenzymaticmechanismunderlyingthesynthesisofadenosinetriphosphate(ATP)""forthefirstdiscoveryofanion-transportingenzyme,Na+,K+-ATPase"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry115TheNobelPrizeinChemistry2002JohnB.FennKoichiTanakaKurtWüthrich"forthedevelopmentofmethodsforidentificationandstructureanalysesofbiologicalmacromolecules""fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules""forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry216TheNobelPrizeinChemistry2003PeterAgreRoderickMacKinnon"fordiscoveriesconcerningchannelsincellmembranes""forthediscoveryofwaterchannels""forstructuralandmechanisticstudiesofionchannels"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry217TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry218TheNobelPrizeinChemistry2009"forstudiesofthestructureandfunctionoftheribosome"VenkatramanRamakrishnanThomasA.SteitzAdaE.YonathFrom/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry219内螺旋外螺旋选择筛钾离子通道的三维结构图2003年诺贝尔化学奖钾离子透过细胞膜的输运行为，对体内或是大脑中神经信号的传导至关重要。然而离子通道的选择性透过行为却困扰了生物学家许多年。内螺旋外螺旋选择筛钾离子通道的三维结构图2003年诺贝尔化学20钾离子通道的离子导通机理通过钾离子通道的三维结构，解释了它对离子的选择性透过机理。（1）“多离子透过”的过程：原先通道里有三个钾离子被束缚在里面，只有体积合适的钾离子才能通过撞击，将另一个钾离子从相反方向弹出，而体积较小的纳离子不行。（2）通道内氨基酸残基的结构，模拟了钾离子在溶液中的水合状态。只有水合的钾离子能够在通道内犹如在水溶液内一样自由地运动。钾离子通道的离子导通机理通过钾离子通道的三维结构，解释了它对21钾离子通道RodMacKinnon,RockefellerUniversityPotassiumion(centerredball)intheK+Channelat3.2Åresolution.PreferentialflowofK+ionsconstitutestheelectricalcurrentinnervecells.Science

280,69-77(1998)Cell

95,649-655(1998)Science

289,123-127(2000)Nature

414,37-42(2001)Nature

414,43-48(2001)Nature

415,287-294(2002)Cell111,967-965(2002)Nature423,33–41(2003)钾离子通道RodMacKinnon,Rockefelle22结构生物学进展：

Roadtostructureswithoutcrystals董宇辉BSRF，IHEP，CAS结构生物学进展：

Roadtostructureswi23Outline同步辐射（SynchrotronRadiation）小角散射（SmallAngleX-rayScattering）自由电子激光（FreeElectronLaser）Outline同步辐射（SynchrotronRadiat24同步辐射

SynchrotronRadiationLettherebelight:andtherewaslight.--Genesis同步辐射

SynchrotronRadiationLet25X射线晶体学和NMR是蛋白质结构测定的主要技术/pdb/statistics/holdings.do，2012年10月2日99.2%测定方法蛋白质结构X射线晶体学74768NMR9616EM综合方法45851Other165总数85058X射线晶体学和NMR是蛋白质http://www.pdb.o26各种生物基因组和功能基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测定样品制备蛋白结构蛋白质结构测定的流程靶标克隆表达可溶纯化结构152721486664081474843802008.6.16/cgi-bin/report.pl各种生物基因组和功能基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测27获得生物大分子结构的主要技术核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月的数据收集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体的获得困难。实验耗时单晶难以获得相位解析需要特殊单晶分辨率低灵敏度低获得生物大分子结构的主要技术核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够28Howtoobtainstructuresbyproteincrystallography?Expression/purificationcrystallizationX-raydiffractionphasingModelbuildingRefinedstructureHowtoobtainstructuresbypr29蛋白质晶体衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S；晶体质量差，晶胞大；相位问题解决困难。理想的光源必须具有以下特点：高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的数据；准直性好：质量差、晶胞大的晶体也可以进 行实验；能量可调：多波长反常散射解决相位问题。同步辐射正好提供了适合的光源。蛋白质晶体衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S；理想的光30什么是同步辐射？接近光速运动的电子或正电子在改变运动方向时放出的电磁辐射，因为是在同步加速器上发现的，所以称为同步辐射。这种辐射强度高、覆盖的频谱范围广，可以任意选择所需要的波长且连续可调，因此成为一种科学研究的新光源。什么是同步辐射？接近光速运动的电子或正电子在改变运动方向时放31同步辐射装置示意图Booster储存环部分图片来自SSRL同步辐射装置示意图Booster储存环部分图片来自SSRL32三种发光元件弯转磁铁扭摆器(Wiggler)波荡器(undulator)图片来自SSRL三种发光元件弯转磁铁扭摆器(Wiggler)波荡器(undu33发光元件光束线实验站发光元件光束线实验站34同步辐射的亮度（单位时间，单位面积，单位立体角，一定光子能量范围内的光子数）和转靶X光机的比较。图片来自MAXIV设计报告同步辐射的亮度（单位时间，单位面积，单位立体角，一定光子能量35Divergence2p立体角：180°1毫弧度：0.06°三代光源甚至达到10微弧度Divergence2p立体角：180°1毫弧度：0.0636实际的蛋白质单晶真实单晶体内部不是完美的，可以看成有一系列的小晶体镶嵌而成，每个小晶体可以认为是完美的晶体。这些小晶体取向无序的程度以“镶嵌度”表征。实际的蛋白质单晶真实单晶体内部不37分子置换法（Molecular

Replacement，MR）同晶置换法（Isomorphous

Replacement，IR，SIR/MIR）反常散射法（Anomalous

Dispersion，AD，SAD/MAD）直接法（Direct

method）Phasing

methods分子置换法（MolecularReplacement，MR38Energyrange同步辐射覆盖了一个很宽的频谱范围，从远红外到硬X光。而X光机只能提供几个分立的光子能量。Energyrange同步辐射覆盖了一个很宽的频谱范围，从39MIR（多对同晶置换）设法在蛋白质晶体中加入一些重金属离子，同时晶体结构不发生大的变化（同晶置换），置换前后结构因子的关系。MIR（多对同晶置换）设法在蛋白质晶体中加入一些重金属离子，40一个同晶置换可以得到两个可能的解。一个同晶置换可以得到两个可能的解。41两个同晶置换就可以得到唯一的解。两个同晶置换就可以得到唯一的解。42“同步辐射+硒代+样品冷冻”已经成为解析全新结构的标准方法。“同步辐射+硒代+样品冷冻”已经43多波长反常衍射（MAD）MIR可以解析全新结构，如果能够得到足够的同晶置换晶体的话。如果蛋白质里有金属离子存在，就可以使用MAD方法。硒代。多波长反常衍射（MAD）MIR可以解析全新结构，如果能够得到44原子散射因子原子散射因子45MAD选择吸收边附近的几个波长，相当于几个不同的完全同晶的置换。分子生物学提供了硒代的手段，对于解析全新结构非常有利。关键是衍射实验使用的X射线（能量）波长必须可变！MAD选择吸收边附近的几个波长，相当于几个不同的完全同晶的置46同步辐射的作用同步辐射的加入，大大提高了结构测定的速度。同步辐射的作用同步辐射的加入，大大提高了结构测定的速度。47PDB(ProteinDataBank)图片来自http:///蛋白质结构的增加PDB(ProteinDataBank)图片来自http48同步辐射促进了蛋白质结构的解析1980-1990年，获得解析的蛋白质数量大幅度增加；1980左右，同步辐射开始应用到蛋白质结构解析中，1990年各种技术趋于成熟，同步辐射大规模应用于生物大分子结构解析。同步辐射促进了蛋白质结构的解析1980-1990年，获得解析49生物学家的评论生物大分子结构测定影响了生物学几乎所有的领域。几乎每个星期都有激动人心的结构发表在如Science和Nature这样的杂志上。生物大分子晶体学已经比其他任何学科更多地得益于同步辐射的应用。

------StevenE.Ealick，CornellUniv.生物学家的评论生物大分子结构测定影响了生物学几乎所有的领域。50MAD实验的波长选择f1f2f3f4MAD实验的波长选择f1f2f3f451四个可选择的波长f1：peak，f"最大；f2：inflection，f'最大；f3：highenergyremote；f4：lowenergyremote。流行做法：一边收集数据，一边解析结构。一般完成f1数据的收集，进行f2数据收集时就完成相位解析了。四个可选择的波长f1：peak，f"最大；52几个波长？理论上2个波长就足够破解双解了，但是有直接法的帮助，1个波长也就足够了。当然波长越多会越好，但是实验时间的延长往往会带来不可预知的因素：辐射损伤，仪器设备的不稳定等。几个波长？理论上2个波长就足够破解双解了，但是有直接法的帮助53反常衍射的分类单波长反常衍射：SAD；多波长反常衍射：MAD。反常衍射的分类单波长反常衍射：SAD；54Peak波长得到的相角三个波长得到的相角烯醇酶-磷酸酶E1

Peak波长得到的相角三55人源“Coactosin-like”蛋白peak与h-remote的组合三个波长人源“Coactosin-like”蛋白peak与h-re56同步辐射蛋白质晶体学的发展更小的晶体：生长晶体是蛋白质晶体学的瓶颈，如果能够解析小晶体的结构将使得许多困难的结构成为可能。更自动化的实验流程：无论是解析结构还是在药物研究中的应用，大量的尝试需要自动化的流程。同步辐射蛋白质晶体学的发展更小的晶体：生长晶体是蛋白质晶体学57目前，10微米左右的质量良好的晶体已经能够解析出生物大分子结构。（ESRF，发表于J.Mol.Biol.,367,310-318.2007）SSRF：可能达到5微米。但是有相当多的生物大分子只能够获得1微米左右的微晶，如左图所示的与老年性痴呆相关的蛋白质很难形成大的单晶。目前同步辐射装置希望能提供1微米的聚焦光斑解析这些

m大小晶体的结构。将大大降低生物大分子结晶的门槛，极大地推动结构生物学研究和药物研发的进展。1m量级蛋白质晶体的结构解析目前，10微米左右的质量良好的晶体已经能够解析出生物大分子结58Summary同步辐射提供了解析蛋白质结构最适合的光源。同步辐射的广泛应用，分子生物学技术的发展以及蛋白质晶体学理论、软件的完善，使得解析蛋白质结构成为相对比较常规的技术。Summary同步辐射提供了解析蛋白质结构最适合的光源。59小角散射

SmallAngleX-rayScatteringSimplestisthebest.小角散射

SmallAngleX-rayScatter60获得生物大分子结构的困难核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月的数据收集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到的。实验耗时单晶难以获得相位解析需要特殊单晶分辨率低灵敏度低获得生物大分子结构的困难核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不61NMR技术可以研究溶液状态的蛋白，但是受到很多限制测定一系列二维、三维核磁共振谱，通过谱峰位置计算原子之间的键长、键角、二面角等立体化学参数，从而得到整个分子的三维结构。存在的限制：灵敏度不够：需要很浓的溶液分辨率不高：存在分子量上限（<39kD）采集速度慢：样品稳定性问题缺少弱相互作用和中间体捕获技术膜蛋白结构的测定方法不完善NMR技术可以研究溶液状态的蛋白，但是受到很多限制测定一系列62蛋白质晶体学的问题主要在于样品得到晶体探测衍射点强度确定衍射相位得到电子密度分布进而获得原子位置主要问题：单晶难于制备，特别是复合物解析相位需要特殊晶体蛋白质晶体学的问题主要在于样品得到晶体主要问题：63小角散射（SAXS）不需要晶体，在溶液中就可进行实验。不受分子量限制。不受浓度限制。实验时间短，对样品稳定性要求低。仪器设备简单，可以开展原位实验。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa小角散射（SAXS）不需要晶体，在溶液中就可进行实验。图片来64小角散射所需的样品~50微升溶液；蛋白浓度在0.1-10mg/ml；分子量在几千至几亿Da；单分散（mono-disperse）。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa小角散射所需的样品~50微升溶液；图片来自RIKENSPr65小角散射的优点对样品的要求很低：溶液样品既可，分子量、浓度不拘，稳定性不用很高。有些时候结晶会引起一些结构上的变化（由于结晶时候的packingforce导致），小角散射实验在溶液中进行，更好地反映生物大分子的真实状态。实验相对简单快速，提供了原位研究动态过程的可能性。小角散射的优点对样品的要求很低：溶液样品既可，分子量、浓度不66小角散射（1D）vs衍射（3D）1条谱线 上万个衍射点结构信息（3D）小角散射（1D）vs衍射（3D）1条谱线 67图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa图片来自RIKENSPring-8CenterDr.68小角散射的缺点小角散射得到的信息量很少，要得到三维的结构信息是很困难的。只能得到一些比较粗略、低分辨的信息，如生物大分子的大小、形状等。衍射可以获得非常多的衍射点强度，能够解析出三维的结构来。相对于晶体学衍射，小角散射的理论还不够成熟。小角散射的缺点小角散射得到的信息量很少，要得到三维的结构信息69经典应用生物大分子（散射体）的大小、分布；大致形状（球形、柱形、椭球形等）。分子越大，实验越容易：和晶体学正好相反。经典应用生物大分子（散射体）的大小、分布；70最近发展可以拟合出生物大分子的形状：Shapedetermination利用一系列球谐函数表征分子外形，这个外形（包络）之外密度为零，之内是均匀的密度。或者用一系列的虚拟原子（dummyatoms）或者虚拟残基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子或者虚拟残基的位置来确定分子形状。最近发展可以拟合出生物大分子的形状：Shapedeter71M.B.Kozin,V.V.VolkovandD.I.SvergunJ.Appl.Cryst.(1997).30,811–815用球谐函数展开来表示生物大分子形状。拟合展开系数，使得计算谱线与实验最接近。需要正则化方法来进行拟合。程序：gnomD.I.Svergun，J.Appl.Cryst.(1992).25,495–503M.B.Kozin,V.V.Volkovand72用虚拟原子来表示生物大分子形状。模拟退火这些虚拟原子的位置，使得计算谱线与实验最接近。程序：damin和gasborD.I.Svergun，BiophysicalJournal(1999).76,2879–2886用虚拟原子来表示生物大分子形状。模拟退火这些虚拟原子的位置，73重建晶体结构中丢失部分晶体衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的loop区域。利用小角散射可以拟合出这些loop区域来。程序：credoPetoukhov,Eady,Brown,andSvergun，BiophysicalJournal(2002).

83,

3112–3125重建晶体结构中丢失部分晶体衍射中看不到的部分一般都是一些柔性74生物大分子复合物已知各亚基分子结构，而复合物结构未知；改变亚基相对位置及取向来拟合实验谱线。程序：masshaKonarev,PetoukhovandSvergun，J.Appl.Cryst.(2001).34,527–532生物大分子复合物已知各亚基分子结构，而复合物结构未知；改变亚75研究实例（一）

从基因到功能：dCMP脱氨酶研究实例（一）

从基因到功能：dCMP脱氨酶76Smu206：AnunknownproteinfromS.mutanscatalyzesthedeaminationofdCMPtodeoxyuridine-5’-monophosphate(dUMP);containsaZn2+whichisimportantforthecatalysis;catalyticactivitydependsonthefeedbackregulationbasedontheratioofdCTPtodTTP,whichareboththeendproductsofthepyrimidinesalvagepathway.Fromthegenesequence,smu206fromStreptococcusmutansUA159shouldbedeoxycytidylatedeaminase.Smu206：Anunknownproteinfrom77oroticacidUMPCMPRNAdUMPdCMPdCDPdCTPdTMPdTDPdTTPDNAdCDisanenzymeinvolvinginpyrimidinesalvagepathway.ItcatalysesthedeaminationofdCMPtodUMP,whichisthesubstrateofthymidylatesynthaseforproducingTMP.dCDreducestheefficiencyofanticancerandantiviraldrugsviadeaminationatthenucleotidelevel,thisindicatesthatdCDinhibitorshavepotentialapplicationsinchemotherapy.oroticacidUMPCMPRNAdUMPdCMPdC78+H2OdCMPdeaminasedCMPdUMPdCTPdTTPMg2+activatorinhibitorMg2+ThedeanimationofdCMPtodUMP.dCTPasactivatorwhiledTTPasinhibitor.AMg2+isnecessaryforthefunctionofdCTPordTTP.+H2OdCMPdeaminasedCMPdUMPdCTP79RegulationofC&TamountsAGTCdCMPExcessiveCmeansinsufficientT,reactionstarts:dCTPactivating;ExcessiveT,reactionsuppresses:dTTPinhibiting.dTTPinhibitingdCTPactivatingRegulationofC&TamountsAGTCd80KineticassayofSm206:yes,itisSm-dCDTheactivityofdCMP;TheregulationofdCTP/dTTPratio.KineticassayofSm206:yes,i81StructuredeterminationofSm-dCDExpressedinE.coli.Purification,Crystallation.Znfound.StructuresolvedviaZn-MAD.Resolutionof2.8Å.Complexofenzyme,substrateanalogPdR(pyrimidine-2-onedeoxyribotide)andactivatordCTPisalsocrtstallized.Structuresolvedto1.65Å.StructuredeterminationofSm-82ThecrystalsSample:8mg/mlSm-dCDReservoir:0.1MTris-HCl,1.5M(NH4)2SO4,15%(v/v)glycerol.Growthunder20°C,3days.Dehydrationwasusedtoimprovethediffraction.Sample:10mg/mlSm-dCD,1mMPdR,5mMdCTPand5mMMgCl2.Reservoir:0.1MMES,1.6M(NH4)2SO4,12%(v/v)dioxane.Growthunder20°C,5days.ThecrystalsSample:8mg/mlSm-83StructuredeterminationofSm-dCDStructuredeterminationofSm-84ThestructureofSm-dCDThesubstrateanalogPdRisfoundasitshydratederivativeDHOMP(3,4-dihydrouridine-5’-monophosphate)ThestructureofSm-dCDThesub85ThehexamerofSm-dCDTheallostericregulatordCTPisfoundbetweentwomonomers.ThehexamerofSm-dCDTheallos86结构生物学介绍和进展ppt课件87TwodifferentZnionsTwodifferentZnions88TherolesofZnindCDfunctionOneZnionisimportantforthecatalysis.ItbindstoHis71,Cys99,Cys102andDHOMP.Theseresiduesarehighlyconservedinallspecies.AnotherZniondoesnotcomeindirectcontactwiththesubstrateanalogandtheallostericregulator.Itplaysaroleintheloopstability,whichshapesthesitethatbindsthephosphategroupofthesubstrateanalog.TheresiduesaroundthisZnionarenotconserved.MammaliandCDsdonotcontainthisZnion.TherolesofZnindCDfunctio89ConformationmodificationduetoDHOMPanddCTPbindingApoenzyme:openconformation(blue);Complex:closeconformation(red).Conformationmodificationdue90ModificationofquaternarystructureAdimerisolatedfromthehexamer.ThebindingofDHOMPanddCTPresultinadenserhexamerandfavorablefortheproteinfunction.Apoenzyme:blue;Complex:red.Modificationofquaternarystr91CatalyticmechanismCatalyticmechanism92研究实例（二）：CooA来源于光合细菌Rhodospirillumrubrum的CO-oxidationactivatorprotein(CooA)。CooA结合CO后导致构型变化，以结合特定的DNA。这个蛋白属于catabolitegeneactivatorprotein(CAP)家族，与fumarateandnitratereductase(FNR)andthecAMP-receptorprotein(CRP)类似。FromShujiAkiyamaetal.,J.Mol.Biol.(2004)341,651–668.研究实例（二）：CooA来源于光合细菌Rhodospiril93图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa图片来自RIKENSPring-8CenterDr.94图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa图片来自RIKENSPring-8CenterDr.95图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa图片来自RIKENSPring-8CenterDr.96CooA在结合CO后的变化并不支持晶体学研究的结果。Guinierplotof：CO-freeCO-boundedCO的结合对CooA大小改变很小。增强了蛋白之间的相互作用，表面电荷分布改变了。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawaCooA在结合CO后的变化并不支持晶体学研究的结果。Guin97SAXS的结果的仔细分析否认了CooA的linear-bent机制。Rg以及P(r)的变化远比linear-bent机制导致的小。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawaSAXS的结果的仔细分析否认了CooA的linear-ben98导致晶体学结构出问题的原因：

结晶时产生的Packingforce通过晶体学得到的结构计算出来的SAXS曲线和实验明显不同，说明在结晶过程中packingforce改变了蛋白的结构。晶体学结构中两个DNA结合区域明显不对称（而CO结合区域却是对称的），这种结构并不常见。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa导致晶体学结构出问题的原因：

结晶时产生的Packingf99图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa图片来自RIKENSPring-8CenterDr.100研究实例（三）：GltS来源于Azospirillumbrasilense（巴西固氮螺菌）的glutamatesynthase(谷氨酸合成酶，GltS)。细菌的NADPH-dependentGltS(NADPH-GltS)包括两个亚基：a亚基，162kDa；b亚基，52.3kDa。a亚基结构已知：1ea0。b亚基有个类似物：residues50–520ofpigliverDPD(1h7w)。（N-terminalregionofporcinedihydropyrimidinedehydrogenase）M.V.Petoukhov,D.I.Svergun,P.V.Konarev,S.Ravasio,R.H.H.vandenHeuvel,B.Curti&M.A.Vanoni(2003).J.Biol.Chem.,278,29933研究实例（三）：GltS来源于Azospirillumbr1012×L-glutamateNADP(+)L-glutamine2-oxoglutarateNADPH+++Fromhttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/enzymes/2×L-glutamateNADP(+)L-gluta102谷氨酸合成酶GltS是一种含有Fe-S中心的黄素蛋白，催化L-谷酰胺的酰胺基还原转移到2-酮戊二酸（2-OG）的C-2位上。根据不同的酶种类，这个过程需要NADH或者NADPH，还需要FAD或者FMN，Fe-S中心是必须的。细菌的GltS需要NADPH，真核生物的需要NADP。这个酶和谷酰胺合成酶（glutaminesynthetase）是微生物和植物中氮素同化（ammoniaassimilation）的主要途径，在动物中的作用还不清楚。细菌包含的NADPH-dependentGltS（NADPH-GltS）由a、b两个部分组成，包含1个FAD，1个FMN和3个不同的Fe-Sclusters。谷氨酸合成酶GltS是一种含有Fe-S中心的黄素蛋白，催化L103NADPH-GltS的催化机理示意图NADPH-GltS的催化机理示意图104活性的Glts是a和b亚基组成的holoenzyme。小角散射结果表明a亚基在溶液中是4聚体；b亚基是单体和二聚体混合。两个亚基组成的holoenzyme在溶液中是4聚体。活性的Glts是a和b亚基组成的holoenzyme。105SAXS实验结果：1：a亚基；2：Glts；3：b亚基。黑点：实验数据；红线：abinitio模型（外形）；绿色点划线：a2（曲线1）和a4b（曲线2）晶体学模型；绿色三角（曲线3）：单体b；绿色圆（曲线3）：二体b；蓝线：刚体拟合后的a4（曲线1）和(ab)4；蓝色圆（曲线3）：拟合后的b单体与二体混合模型。SAXS实验结果：106a4Gltsb2a4重叠在Glts上外形a4Gltsb2a4重叠外形107a4Gltsb2a4Gltsb2108a4ab(ab)4最终确定的结构：4聚的a亚基外围包围着4个b亚基。a4ab(ab)4最终确定的结构：109Summary小角散射提供了研究生物大分子溶液状态的一种方便手段。实验数据能够提供的信息量不多，但是在有部分晶体结构的情况下，小角散射能够发挥相当重要的作用。小角散射研究生物大分子溶液结构仍是一种正在发展的技术，有很大的提升余地。Summary小角散射提供了研究生物大分子溶液状态的一种方便110自由电子激光

FreeElectronLaser发展才是硬道理。--邓小平自由电子激光

FreeElectronLaser发展才是111各种生物基因组和功能基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测定样品制备蛋白结构晶体，晶体，晶体！靶标克隆表达可溶纯化结构152721486664081474843802008.6.16/cgi-bin/report.pl各种生物基因组和功能基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测112解决的方法：分子不排队，让光子排队探测器分子相干光源利用一束相干性很好、强度很高的X光来照射分子，记录下相干散射的强度，也能得到分子中原子的结构。解决的方法：分子不排队，让光子排队探测器分子相干光源利用一束113晶体的衍射：虽然每一个光子到达晶体的时间（位相，phase）是无规的，但是晶体内原子空间排列的有序性限定了出射光子只能沿着有限的方向，因此出射的X射线强度还是很高的，可以很容易就探测得到。晶体的衍射：虽然每一个光子到达晶体的时间（位相，phase）114分子的散射：在原子空间排列无序的条件下，出射光子的方向不受限制，因此出射的X射线强度变得非常微弱。入射X射线的光子如果没有确定的位相关系（相干），那么即使目前最强的光源，这些无序到达的光子产生的信号还是弱得无法探测。（强度相加，N个光子N倍信号）分子的散射：在原子空间排列无序的条件下，出射光子的方向不受限115除非入射X射线的光子“排着整齐的队伍”，具有确定的位相关系（相干），散射的光子产生的信号就有确定的相位关系，能够进行振幅叠加，N个光子产生N2倍信号（类似共振）。除非入射X射线的光子“排着整齐的队伍”，具有确定的位相关系（116关键：光源目前的光源（包括第三代同步辐射）还不能提供足够的强度和相干性；能够满足条件的光源是：X射线自由电子激光（XFEL）。理由：原子分辨率需要X光；强度和相干性需要激光。关键：光源目前的光源（包括第三代同步辐射）还不能提供足够的强117什么是自由电子激光？让产生同步辐射的电子同时发光（光子相位相同），这样就得到激光。这个过程和常规的激光（可见光、红外、紫外激光）是类似的。什么是自由电子激光？让产生同步辐射的电子同时发光（光子相位相118结构生物学介绍和进展ppt课件119溶菌酶溶菌酶120Thesmall30S-subunitoftheThermusThermophilusribosomeThesmall30S-subunitof121可能的问题分子损伤：极高的强度会使分子完全离解，但是XFEL可以在分子离解之前就得到足够的信号，计算机模拟证实了这一点。相位问题：过采样技术（oversampling）可以解决这个问题。探测技术：需要发展。实验技术：如何获得单分子的散射信号，需要研究。可能的问题分子损伤：极高的强度会使分子完全离解，但是XFEL122XFEL作用下溶菌酶分子的离解2fs的脉冲可以得到可靠的结构，5fs以上会有误差，10fs以上基本不可用。XFEL作用下溶菌酶分子的离解2fs的脉冲可以得到可靠的结构123实验技术的问题强度很高的XFEL，怎么固定样品？既然能够把样品在瞬间挥发，也会在瞬间挥发固定样品的样品架！实验技术的问题强度很高的XFEL，怎么固定样品？既然能够把样124实验技术（1）：

Sprayingtechniques实验技术（1）：

Sprayingtechniques125实验技术（2）：

Samplesembeddedinvitreousice把蛋白质固定在非晶态的冰里面。类似冷冻电镜技术。实验技术（2）：

Samplesembeddedinv126使用一束脉冲足够短的激光，就可以得到可信的散射信号。但是散射信号如何变成结构（电子密度）？相位还是探测不到。使用一束脉冲足够短的激光，就可以得到可信的散射信号。但是散射127晶体衍射相位问题的根源：傅立叶取样定律和衍射的中心对称性结构解析就是求出晶胞内电子密度分布：需要得出N个点的密度r(xj,yj,zj,j=1,…,N)，必须知道N个振幅F(hm,km,lm,m=1,…,