火炬松成熟合子胚体胚培养研究

火炬松成熟合子胚体胚培养研究

体育速度是最理想的，具有自动化快速繁殖的优势，是一种更精确、更快速繁殖的系统育种和快速繁殖技术。1材料和方法1.1种子和贮藏方法以火炬松成熟合子胚为外植体。火炬松成熟种子由美国弗吉尼亚州理工学院及州立大学提供,参试家系为AL615*658,采收的种子贮藏在5℃的冰箱备用。1.2菌水冲洗和水浸成熟种子用自来水冲洗3次后,在超净工作台上用70%~75%的酒精进行表面消毒60s,用无菌水冲洗2次后,再用2%的次氯酸钠溶液中振荡消毒3min,用无菌水冲洗4次以上,每次冲洗时间不少于2min,消毒好的种子用常温无菌水浸种24h备用。在超净工作台上,将浸泡过的种子剥去种壳后,按上述无菌消毒程序再重复消毒1次,但次氯酸钠溶液消毒时间不超过1min。1.3不同植物生长添加剂的组合对体育细胞的诱导作用参照火炬松未成熟合子胚体胚诱导培养基1.4合子胚接种培养基方式一:完整的成熟合子直接接入培养基;方式二:合子胚与胚乳剥离后,合子胚连同胚乳一起接入培养基,并保持胚根端与胚乳接触;方式三:以方式二将合子胚接入培养基,再添加胚乳提取液0.05mL。胚乳提取液的制备方法参照Egertsdotter1.5对比试验试验试验以千粒重29.77g与43.03g的2种规格的种子(经人工挑选)进行对比试验。以接种方式二将外植体接入AL-TX、TX-TX、LP-TX、LP-LP培养基,在(23±2)℃培养室,全程无菌、全暗培养40d后调查诱导率。1.6培养条件观察和增殖培养将诱导培养获得的胚性胚柄细胞团(ESM)及时转接到维持培养基(即原诱导培养基),观察ESM在维持培养过程的形态变化,统计存活率。连续3代的维持培养后,转入增殖培养基(试验以植物生长调节剂减半AL-TX为增殖培养基),每20d为1个继代周期。培养室温度为(23±2)℃,采用全程无菌、全暗培养方式。1.7体育研究参照花旗松体胚成熟培养程序2结果与分析2.1体胚的早期解剖采用接种方式二,即合子胚与胚乳剥离后,一同接入诱导培养基。培养14~21d,部分合子胚子叶转绿,子叶和上胚轴间产生白色、透明小突起(图1A);35~42d后,在解剖镜下可见早期体胚的胚头(图1B)。大部分合子胚下胚轴与胚根间产生淡黄色、松散型、颗粒状非胚性、非器官性愈伤组织火炬松成熟合子胚体胚直接源于合子胚上胚轴与子叶之间,形成的胚性胚柄细胞团由早期体胚组成,没有经过愈伤组织阶段。唐巍等2.2体胚获得体胚由表3可见,3种接种方式中,仅有第2种方式获得体胚;由此推断合子胚连同胚乳接种有利于体胚的诱导,这可能与胚乳能提供体胚诱导的某些活性物质有关2.3体胚的平均诱导率由表4可见,种子千粒重为43.03g的合子胚在4种培养基上均获得体胚,种子千粒重大,其平均诱导率越高。这可能是颗粒大的种子,合子胚大且胚乳更为饱满,在离体培养时能提供体胚发生所需的有效成分。说明挑选种粒饱满的种胚为外植体有助于提高体胚诱导率。2.4sm失去胚性将具有典型丝状结构的ESM转入原诱导培养基进行胚性维持培养,经过3次连续转代后,仅有35%的ESM保持其典型的丝状结构;25%的ESM失去胚性,解剖镜下可见培养物表面仅有少量体胚,培养物多为游离单细胞或团状多细胞(似“原胚”结构);而约有40%ESM或褐化死亡,或失去胚性。将ESM转入植物生长调节剂减半的AL-TX培养基进行增殖培养,在连续1a的继代增殖培养过程中,大多数ESM失去胚性或增殖能力,或生长速率衰退而死亡,仅获得2个具有长期继代增殖能力的胚性细胞系AL-225、AL-273(图1C、图1D)。2.5体胚发育情况不同胚性细胞系体胚质量影响体胚的发育和成熟。AL-273细胞系为后期原胚细胞团组成,转入6种成熟培养基均未见体胚的发育成熟。胚性细胞系AL-225为典型的ESM结构,由发育1阶段体胚组成,转入6种成熟培养基后各有不同的成熟反应(表5、图2);在1和3号培养基中,体胚发育为第3~5阶段,添加AC促进体胚的进一步发育,但未添加AC的3号培养基体胚质量最高,形状更似合子胚。未添加PEG的2号培养基,体胚发育相对迟缓,主要以第2阶段的体胚为主。PCIB是抗生长素抑制剂,能抑制增殖和促进高质量成熟胚的发育。而本试验中,添加PCIB(4号培养基)促进体胚胚头增大,而胚柄细胞呈游离态,体胚逐渐死亡。这可能是树种、基因型不同内源生长素浓度水平导致的差异。未添加ABA的5号培养基体胚呈畸形态。未经无植物生长调节剂培养基预培养阶段,ESM继续增殖,体胚未见进一步发育。尽管1、3号培养基获得了发育3~5阶段的体胚,但继续培养均未能获得子叶胚和完全成熟的体胚。这是否与胚性细胞系的基因型有关,有待于进一步研究。3体胚诱导体胚发生的重复性差火炬松成熟合子胚体胚诱导率较非成熟合子胚诱导率低。未成熟合子胚体胚诱导率高达40%火炬松成熟合子胚诱导体胚发生可重复性差。一方面与外植体基因型有关,另一