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植物组织培养专项

1/68一、植物组织培养概念植物组织培养：

是指在无菌条件下利用人工培养基对离体植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养。2/68外植体（explant）：由活体植物体上切取下来，用于组织培养多种接种材料。包括多种器官、组织、细胞或原生质体等。愈伤组织（callus）：原指植物受伤后在伤口表面形成一团薄壁细胞；在组织培养中，是指在人工培养基上由外植体形成一团无序生长具有旺盛分裂能力薄壁细胞。3/68二、植物组织培养技术理论基础植物细胞全能性(Plantcellulartotipotency）从理论上讲，植物体每个生活细胞都具有该植物体所有遗传信息，在特定离体培养条件下，具有发育成完整植株潜在能力。

4/68从理论上讲，植物具有全能性细胞有三类：（1）受精卵（2）发育中分生组织细胞：可取自分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等；（3）雌雄配子及单倍体细胞：胚囊及卵细胞、花粉及精子细胞。5/68三、植物组织培养类型1.按培养材料分为：

愈伤组织培养最为常见组织培养

器官培养

胚、胚乳、子房、根、茎、叶花和幼果部分组织培养

悬浮细胞培养茎尖分生组织培养原生质体培养游离单细胞培养细胞团培养6/68常用组织培养有茎尖培养、芽尖培养、花器官培养、发状根培养等。其中：（1）茎尖培养、芽尖培养：植物迅速繁殖常用办法；（2）花器培养和茎尖培养：取得无病毒植株主要途径；（3）发状根培养（土壤农杆菌侵染形成“病态”根）：主要目标为取得某些次级代谢产物。在迅速繁殖中，最常用培养材料是茎尖，一般切块在0.5cm左右。但假如为培养无病毒苗，一般仅取茎尖分生组织部分，其长度在0.1mm下列。7/68

人工种子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物离体培养产生胚状体或不定芽被包裹在具有营养和保护功能人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗颗粒体。作为繁殖材料。8/68藻酸钠在室温下为液体，很适合于制造人工种子。当体细胞胚与藻酸钠混合后，再滴入硝酸钙或氯化钙溶液中，30min内表面形成一层持久种皮。人工胚乳含植物激素、蔗糖、无机盐等物质9/68人工种子长处1.建立高效迅速植物无性繁殖办法（无性繁殖植物）。2.对于制种困难优秀杂种种子能够迅速取得大量种子。3.与田间制种相比，能够节省制种用地，且不受季节限制。4.与利用试管苗相比，可避免移栽困难，实现机械化操作，便于储藏和运输。10/682、根据培养基类型分为:

（1）固体培养（Solidculture）:琼脂、卡拉胶等固化。（2）半液半固体培养(SemisolidCulture)：固液双层。（3）液体培养(LiquidCulture)：震荡(摇床）、旋转或静置培养。11/682、根据培养基类型分为:

1）．固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料办法。是目前最常用办法。虽然该办法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。2）．液体培养法即用不加固化剂液体培养基培养植物材料办法。由于液体中氧气含量较少，因此一般需要通过搅动或振动培养液办法以确保氧气供应，采取摇床进行培养，这种定期浸没办法，既能使培养基均一，又能确保氧气供应。12/68固体培养：液体培养13/68四、植物组织培养技术途径植物细胞通过再分化形成完整个体能够通过两种途径：器官发生和体细胞胚发生途径。P23（一）器官发生途径：培养条件下组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官过程。（二）胚状体发生途径：是指在愈伤组织中产生出某些与种子中胚相同构造，即同步形成一种有苗端和根端双极性构造，而发育成再生植株途径。14/68直接器官发生间接器官发生直接器官发生：外植体中已存在器官原基，深入培养即形成对应组织器官，进而再生植株。如茎尖、根尖分生组织培养；如菊花组织培养（选修一、试验11）间接器官发生：另一种情况是外植体某些部位细胞，在重新分裂后先形成愈伤组织，然后由愈伤组织分化形成器官原基（选修三p22第二段）15/68制备外植体

将已消毒材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌环境下，剥去芽鳞片、嫩枝外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。（1）直接器官发生途径16/68接种和培养

1.接种

在无菌坏境下，采取顶芽、侧芽或带有芽茎切段，将切好外植体立即接在培养基上，每瓶接种4－10个。

2.封口

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

3.温度

培养基大多应保持在25℃左右，但要因植物种类及材料部位不一样而区分看待。

17/68接种和培养

4.增殖

把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率提升。

5.根诱导

继代培养形成不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可取得键壮根系。18/68炼苗移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上营养基冲洗洁净，再栽入已准备好基质中，基质使用前最佳消毒。移栽前要合适遮荫，加强水分管理，保持较高空气湿度（相对湿度98%左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。19/68外植体脱分化愈伤组织再分化不定芽不定根再生植株（2）间接器官发生途径（选修三p22第二段）再分化20/68小麦愈伤组织器官发生途径先芽后根21/68大蒜根尖培养及植株再生先根后芽22/68通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式:第一种方式是先芽后根;第二种方式为先根后芽;第三种方式是在愈伤组织不一样部位形成芽和根，再通过维管组织联系形成完整植株。23/68（二）体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）：体细胞胚概念：离体培养条件下没有通过受精过程，但通过了胚胎发育过程中所形成胚类似物，统称为体细胞胚或胚状体。体细胞胚发生过程：细胞脱分化后形成类胚构造，然后经历与合子胚相同发育过程，从细胞团、球形胚、心形胚、胚状体24/68（二）体细胞胚发生途径分类

1.从外植体直接发生以叶片为外植体培养中2.经胚性愈伤组织发生3.悬浮培养细胞发生（胚性细胞团）25/68叶诱导形成瘤状物,继续发育，通过球形胚、心形胚等发育过程，最后形成体细胞胚

1.从外植体直接发生——以叶片为外植体培养中26/68胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织再分化胚状体再生植株2.经胚性愈伤组织发生27/68菊花体细胞胚胎发生及植株再生胚状体28/68外植体脱分化再分化胚性细胞胚性细胞特点：细胞质丰富、液泡小而细胞核大。摇床胚状体3.悬浮细胞培养29/68植物组织培养再生植株途径激素调控30/68五、植物组织培养技术应用1、优质种苗迅速无性繁殖：迅速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值植物，不受地理环境和季节限制，达成迅速、高效目标；

园艺植物种苗工厂化生产31/68无毒组织2.通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、甘蔗、马铃薯、大蒜等。所取得脱毒苗一定要通过判定，确认不带病毒才能使用。茎尖培养脱毒32/683、植物种质资源保存、挽救濒于灭绝植物植物组织培养结合超低温保存技术，能够给植物种质保存带来一次大飞跃。由于保存一种细胞就相称与保存一粒种子，但所占空间仅为本来几万分之一，并且在低温液氮中能够长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。33/68

花粉、花药培养产生单倍体植株4、通过花药和花粉培养取得单倍体植株、缩短育种年限。34/68在远源杂交中，杂交后形成胚往往在未成熟状态时，就停顿生长，不能形成有生活力种子，因而杂交不孕，这给远缘杂交造成极大困难。远缘杂交中，由于生理上和遗传上障碍而不能杂交成功，可采取试管受精加以克服，产生杂种胚在试管中发育成完整植株。5、幼胚拯救，克服远缘杂交障碍35/68(1)(1)(2)(3)(4)(5)6、植物细胞融合通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而取得体细胞杂种，从而发明新种或育成优良品种。酶解法（纤维素酶、果胶酶等）甘露醇（较高渗入压）物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）原生质体融合再生壁脱分化再分化36/687、培养细胞突变体应用培养细胞处于不停分生状态，它就容易受培养条件和外加压力（如射线、化学物质）影响而产生突变，用细胞培养进行诱发、筛选和判定期,处理细胞数远远多于处理个体数,因此某些突变率极低性状有也许从中选择出来，从而育成新品种。目前用这种办法已经筛选到抗病、抗盐、高蛋白、高产等突变体，有些已经用于生产。37/68接收目标基因受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养办法才能实现。

8.用于基因工程技术发明植物新种质。38/689、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；中国中草药是一份人类珍贵财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。假如能利用组织和细胞培养办法在试验室内生产，不再依附于自然环境，不但能够处理现有困难，并且能够通过筛选高产有效成份细胞系，来提升其药用价值。例如用培养人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。39/68

根培养:毛状根培养利用培养植物细胞和组织细胞作为生物反应器，有也许生产出人类所需要天然有机化合物,如蛋白质、脂肪、糖类、药品、香料、生物缄及其他活性化合物。也能够生产某些抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在试验中。40/6841/68组织培养详细过程42/68现以MS培养基为例介绍配备培养基主要过程。1．配制MS大量元素母液将大量元素分别配制成母液P602．配制MS微量元素母液将微量元素配制成母液。3．配制MS有机母液肌醇、盐酸硫胺素、烟酸、甘氨酸、盐酸吡哆醇

4．配制MS铁盐母液EDTA二钠、FeSO4•7H2O各自配成母液倒入试剂瓶中，寄存于冰箱中因此MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。，使用时再分别稀释。一.培养基配制43/68激素母液配制多种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起生长素类（NAA萘乙酸）一般要先用0.1mol/LNaOH溶解细胞分裂素（BA苄基腺嘌呤）一般要先用0.1mol/L盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般配成母液冰箱保存44/68二．配制培养基

以配备1LMS培养基为例，按次序进行如下操作：1．先在烧杯中放入某些蒸馏水。2．分别取上面八种母液10ml倒入。3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。5．按设计好方案添加多种激素，由于激素用量很小，并且激素对组培植物生长至关主要。因此最佳用移液器吸取，减少误差。6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7～5.8。可配HCL和NaOH用来调溶液PH值。45/687．称取5g左右琼脂粉，倒入上面配好溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在试验台上令其冷却凝固。46/68三.灭菌有菌范围是：凡是暴露在空气中物体，接触自然水源物体，最少它表面都是有菌。依此观点，无菌室等未处理地方、超净台表面、简单煮沸培养基、我们使用刀、剪在未处理之前、我们身体整个外表及与外界相连内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出气体、培养容器无论洗得多洁净等等都是有菌。47/68三.灭菌无菌范围是：经高温灼烧或一定期间、蒸煮过后物体，经其他物理或化学灭菌办法处理后物体，高层大气、岩石内部、健康动、植物不与外部接触组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌。。48/68因此通过严格灭菌操作空间（接种、超净台等）和使用器皿，以及操作者衣着和手都不带任何活着微生物。在这样条件下进行操作，就叫做无菌操作。49/68常用灭菌办法可分为物理和化学两类，即：物理办法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学办法是使用甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些办法和药剂要根据工作中不一样材料不一样目标合适选用。50/68步骤进行：1．在接种前20分钟，打开超净工作台风机以及台上紫外线灯；2．接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用试验服，并换穿拖鞋等；3．上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，尤其是指甲处。然后搽拭工作台面；4．先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；5．接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；6．接种完成后要清理洁净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。51/68接种是将已消毒好根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基过程。无菌接种步骤：1．将初步洗涤及切割材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌纱布上或滤纸上。2．材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行合适切割。如叶片切成0.5cm平方小块；茎切成具有一种节小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，避免交叉污染。四.接种52/683．用灼烧消毒过器械将切割好外植体插植或放置到培养基上。详细操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口接近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置办法茎尖、茎段要正放（尖端向上）。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。53/68五.培养

培养指把培养材料放在培养室（无光、合适温度、无菌）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织，光照条件下深入分化成再生植株过程。54/681．初代培养

接种某些外植体后，最初几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中具有较多细胞分裂素和少许生长素。1）顶芽和腋芽发育采取外源细胞分裂素，可促进使具有顶芽或休眠侧芽启动生长，从而形成一种微型多枝多芽小灌木丛状构造。在几个月内能够将这种丛状苗一种枝条转接继代，并且迅速取得多数嫩茎。它不通过发生愈伤组织而再生，因此是最能使无性系后裔保持原品种一种繁殖方式。在采样时，只能采取顶芽、侧芽或带有芽茎切段55/682）不定芽发育在培养中由外植体产生不定芽，一般首先要经脱分化过程，形成愈伤组织细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基（这与胚状体不一样）。多数情况下它形成芽，后形成根。另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽能力如矮牵牛等。用靠培养不定芽得到培养物，一般采取芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。56/683）体细胞胚状体发生与发育体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不一样，它也通过球形，心形，鱼雷形和胚状体胚胎发育时期，最后发育成小苗。但它是由体细胞发生。胚状体能够从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化细胞中产生，或从悬浮培养细胞中产生。57/682.继代培养

在初代培养基础上所取得芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，它们需要深入增殖，从而发挥迅速繁殖优势。继代培养是继初代培养之后连续数代扩繁殖培养过程。意在繁殖出相称数量无根苗，最后能达成边繁殖边生根目标。继代培养后裔是按几何级数增加过程。58/68六.驯化移栽

试管苗更适合于高湿环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。一般采取措施有：对外界要增加湿度、削弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐渐减少空气湿度等。另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是由于试管苗在无菌环境中生长，对外界细菌、真菌抵抗能力极差。为了提升其成活率，在培养基质中可进行灭菌处理。59/681．移栽用基质和容器适合于栽种试管苗基质要具有透气性、保湿性和一定肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生特点。一般可选用蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按百分比搭配。这些介质在使用前应高压灭菌。或用最少小火烘烤来消灭其中微生物。草炭土是由沉积在沼泽中植物残骸通过长时间腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强60/682．移栽前准备

移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3天，让试管苗接收强光照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2天，经受较低湿度处理，以适应将来自然湿度条件。61/683．移栽和幼苗管理

从试管中取出发根小苗，用自来水洗掉根部粘着培养基，要所有除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。移植时用一种筷子粗竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，避免弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度环境中。确保空气湿度达90%以上。62/68试管苗在移栽过程中，要把水分平衡、合适介质、控制杂菌和合适光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽。63/68植物组织培养技术发展历史

1、早期摸索阶段（1930年此前）1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。1923年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采取植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物表皮细胞进行培养，但未能培养成活。1923年，Hanning初次对十字花科萝卜和辣根胚培养成功。1923年，Knudson将兰花种子在离体条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花茎尖进行了培养，只形成某些缺绿叶和根。1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻胚培养来克服杂交不亲和性。64/682、植物组织培养技术初步形成（1930-1960年）

1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发觉银杏胚乳提取液可促进离体胚生长。

1937年，White发觉B族维生素对离体根培养主要性。并指出IAA对植物生长发育控制起主要作用。

1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段形成层细胞培养也得到了类似成果。

1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发觉，不定芽和不定根发生由生长素/腺嘌呤百分比决定。

1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生取得器官。65/681952年，Morel和Martin通过度生组织培养取得大丽花脱毒植株，同年