鸡基因组的pcrrflp分析

鸡基因组的pcrrflp分析鸡基因组的pcrrflp分析第1页一、试验方法1、鸡基因组DNA提取2、目标基因PCR扩增3、内切酶消化PCR产物4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）鸡基因组的pcrrflp分析第2页鸡DNA获取

1、鸡翅下静脉采集全血；2%EDTA抗凝；

2、DNA提取：裂解细胞核（红细胞+白细胞）酚-氯仿去除蛋白质酶解RNA获取DNA鸡基因组的pcrrflp分析第3页PCR扩增1、引物设计（Genbank）；

2、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）鸡基因组的pcrrflp分析第4页PCR反应体系

DNA模板

dNTPTaqDNA聚合酶引物

Mg2+

缓冲液鸡基因组的pcrrflp分析第5页PCR反应程序预变性94℃3~5min35循环：变性94℃30s~1min

退火50~65℃30~60s

延伸72℃1~2min

后延伸72℃5~10min鸡基因组的pcrrflp分析第6页PCR产物电泳检测结果鸡基因组的pcrrflp分析第7页

PCR产物+缓冲液+内切酶

5‘-TCATGA-3’3’-AGTACT-5’内切酶消化PCR产物鸡基因组的pcrrflp分析第8页A

B电泳图谱AABBAB电泳检测基因（1）鸡基因组的pcrrflp分析第9页电泳检测基因（2）鸡基因组的pcrrflp分析第10页

实际操作步骤琼脂糖凝胶电泳检测基因型鸡基因组的pcrrflp分析第11页二、试验原理

电荷效应：DNA分子在高于其等电点pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。分子筛效应：与分子大小及构象相关，因为DNA分子或DNA片段分子量差异，电泳后展现迁移位置差异。条带类型对应于基因型。鸡基因组的pcrrflp分析第12页三、试验目标

经过此试验操作，掌握琼脂糖凝胶电泳技术、DNA分离判定及基因型判定方法。鸡基因组的pcrrflp分析第13页四、试验材料、仪器和试剂材料：DNA样品仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、Tip头试剂电泳缓冲液(1×TAE)：0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷-乙酸(tris-乙酸)，0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溴化乙锭(EB10mg/ml)：100ml灭菌双蒸水中加入1gEB1%琼脂糖：100ml1×TAE加入1g琼脂糖上样缓冲液(溴酚蓝-甘油溶液)：先配制1%溴酚蓝水溶液与等体积甘油即可鸡基因组的pcrrflp分析第14页五、试验步骤鸡基因组的pcrrflp分析第15页(一)制胶1.将1.0g琼脂糖加至100ml1×TAE缓冲液中，配成1%琼脂糖。琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至60。C以下。2.加入5ul溴化乙锭（终浓度0.5ug/ml）至熔化琼脂糖液中混匀，但防止出现气泡。3.准备好凝胶成型器。4.将冷却琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶。5.在凝胶一侧放入成型梳，将梳子夹在胶上方桥上，并确保梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。6.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），轻轻去除梳子。配制2L1×TAE缓冲液，用于电泳槽。将缓冲液到入洁净凝胶槽。鸡基因组的pcrrflp分析第16页（二）电泳1.将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。2.凝胶应完全侵入缓冲液，但覆盖缓冲液不要超出1cm。3.取5ul样品加入上样缓冲液，小心将样品加入每一样品槽内4.接通电源，电压4-5V/cm，DNA从负极移到正极。时间30-40分钟。5.关掉电源，结束电泳。鸡基因组的pcrrflp分析第17页1.将电泳完成琼脂糖凝胶置于自动成像系统平台中间2.开通紫外光，在电脑中观察图像；3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保留图像；4.依据图像结果判定不一样个体基因型。六、结果分析鸡基因组的pcrrflp分析第18页

七、作业

1.统计试验结果

2.试验心得

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