蛋白质工程制药汇总课件

04蛋白质工程制药S1蛋白质工程制药概述S2蛋白质工程的基本技术S3蛋白质工程制药实例04蛋白质工程制药S1蛋白质工程制药概述1S1蛋白质工程制药概述从基因工程药物到蛋白质工程药物蛋白质工程的诞生、概念蛋白质工程的基本过程蛋白质分子设计S1蛋白质工程制药概述从基因工程药物到蛋白质工程药物2基因工程药物

蛋白质工程药物1982年第一个基因工程药物：重组人胰岛素重组蛋白存在问题：1、稳定性差：体内半衰期短2、药理活性不够强：使用剂量偏大3、毒副作用大4、生产工艺复杂

蛋白质工程药物基因工程药物蛋白质工程药物1982年第一个基因工程药物：重3蛋白质工程的诞生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸点突变改变DNA序列的方法1982年，一些实验室用此技术来改造蛋白质分子，研究蛋白质的功能1983年，Ulmer发表了题为“ProteinEngineering”的专论目前已应用于医药领域，并有多种产品上市蛋白质工程的诞生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸点4已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短5已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短6已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短7蛋白质工程的概念蛋白质工程（ProteinEngineering）(第二代基因工程)是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计以及DNA重组技术，把天然的蛋白质改造成合乎人类需要的新的突变蛋白质(mutein)的一项技术。蛋白质工程的概念蛋白质工程（ProteinEngineer8蛋白质工程的概念内涵：1、从DNA水平改变基因，改造蛋白质2、一个或多个氨基酸残基结构域全新蛋白质3、有目的地改造，获得期望功能——强调分子设计4、结合DNA重组技术从不同尺度改造蛋白质工程的概念内涵：从不同尺度改造9蛋白质工程的基本过程蛋白质工程的基本过程10蛋白质工程的基本过程1、分离纯化所需改造的目的蛋白2、对蛋白进行氨基酸序列测定、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等——结构和功能信息3、根据结构和功能信息、生物信息学信息，运用蛋白质分子预测技术提出蛋白质设计方案4、分离克隆该蛋白编码基因，并进行突变改造5、插入适当的载体表达6、分离纯化表达产物，检测其生物学功能实验设计实验蛋白质工程的基本过程1、分离纯化所需改造的目的蛋白实验设计实11蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质分子设计三个基本条件12蛋白质分子设计蛋白质分子设计的三个基本条件：1、蛋白质分子的基本知识：理化性质、结构与功能、构象规律2、对具体改造的蛋白质分子必须有一个系统、全面和深入的了解3、分子设计的基本工具：高性能的计算机硬件、功能齐全的计算机软件——只有在此基础上，才能应用蛋白质分子预测技术，提出合理的设计方案三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质分子设计蛋白质分子设计的三个基本条件：1、蛋白质分子的13蛋白质分子设计蛋白质分子设计的分类1、小范围改造：对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换、部分片段的缺失，改善蛋白质的性质和功能。2、较大程度的改造：根据需求对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，或在蛋白质分子中进行大范围肽链替换、结构域替换，获得多功能复合体。3、蛋白质从头设计（denovoproteindesign）三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质分子设计蛋白质分子设计的分类1、小范围改造：对已知结构14概念：从蛋白质分子一级结构出发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白，使之具有特定的空间结构和预期的生物功能。1、需要扎实的理论基础2、在分子设计与试验验证之间交互进行蛋白质从头设计蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略概念：从蛋白质分子一级结构出发，设计制造自然界中不存在的全新15PDA循环（ProteinDesignAutomation）1、设计

模拟

实验

分析2、不断循环：一步步的修正最终获得成功蛋白质从头设计蛋白质分子设计计算机模拟基因构建突变蛋白质产物功能分析三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略PDA循环（ProteinDesignAutomatio16蛋白质从头合成的范例

凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2KLAKLAK：可形成典型的两亲

-螺旋结构，进入细胞后，可破坏线粒体膜引起细胞凋亡NGR：与新生血管的内皮细胞特异结合，起到靶向弹头的作用蛋白质从头设计蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质从头合成的范例KLAKLAK：可形成典型的两亲-螺旋17利用NGR为弹头，将KLALAK肽特异地导向肿瘤部位的新血管内皮细胞，通过抑制新血管的生成，从而抑制肿瘤的形成，且对其他细胞没有明显的毒性。300

mol/L

3

mol/L蛋白质从头合成的范例凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白质从头设计蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略利用NGR为弹头，将KLALAK肽特异地导向肿瘤部位的新18蛋白质从头合成的范例凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白质从头设计蛋白质分子设计考虑的其他因素1、Gly-Gly接头：防止两功能部位的立体结构相互影响。2、L-型氨基酸（D-型）：防止蛋白酶的降解三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质从头合成的范例蛋白质从头设计蛋白质分子设计考虑的其他因19蛋白质从头合成的范例凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白质从头设计蛋白质分子设计实验结果1、特异地被激活的新生血管内皮细胞内吞，引起凋亡2、在小鼠肿瘤模型中，可抑制肿瘤的生长，明显延长治疗组小鼠的存活时间3、对健康小鼠超剂量使用时，没有毒副作用的产生三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略蛋白质从头合成的范例蛋白质从头设计蛋白质分子设计实验结果1、201、顺式思维理性化设计

——合理化设计2、基于各种功能筛选平台的非理性逆向改造策略

——非理性的体外进化3、两种策略的结合蛋白质分子设计的策略蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略1、顺式思维理性化设计蛋白质分子设计的策略蛋白质分子设计三个211、顺式思维理性化设计——合理化设计基于现有知识信息：蛋白质的结构与功能；因此，受到已有认识水平的制约。蛋白质从头设计蛋白质分子设计的策略蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略1、顺式思维理性化设计蛋白质从头设计蛋白质分子设计的策略蛋白222、基于各种功能筛选平台的非理性逆向改造策略——非理性的体外进化1）构建包含众多突变蛋白的文库：随机突变、DNA改组等2）筛选文库：从功能入手进行筛选所需要的蛋白3）进行蛋白质基本结构、序列信息的分析蛋白质分子设计的策略蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略2、基于各种功能筛选平台的非理性逆向改造策略——非理性的体外233、两种策略的结合非理性的体外进化：弥补合理性化设计应用中的局限性，并且迅速得到大量有功能的目标分子，通过分析积累所需的蛋白质结构与功能相关信息合理化设计：对非理性筛选出的候选分子进行合理化的分子修正，使之进一步符合实际需求蛋白质分子设计的策略蛋白质分子设计三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略3、两种策略的结合非理性的体外进化：弥补合理性化设计应用中的24S2蛋白质工程的基本技术定点突变技术随机突变技术1、寡核苷酸引物介导的定点突变2、PCR介导的定点突变3、盒式突变4、易错PCR5、DNA改组技术S2蛋白质工程的基本技术定点突变技术随机突变技术1、寡核苷25易错PCR连续易错PCR（sequentialerror-pronePCR）：经以上一次PCR突变的基因很难获得满意的结果，于是将前一轮PCR扩增得到的有用突变基因作为下一轮PCR的模板，每次获得的突变累积起来，产生重要的有益突变。可遗传的变化只发生在单一分子内部，属于无性进化（asexualevolution）易错PCR（error-pronePCR）：利用缺乏修复功能的Taq酶，并设置容易引起出错的PCR反应条件，在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变——完全随机化易错PCR连续易错PCR（sequentialerror-26易错PCR优点：简便易行不足：突变文库规模有限，有益突变少，后续筛选工作费力、耗时，只适用于较小的基因片段（<800bp）易错PCR优点：简便易行不足：突变文库规模有限，有益突变少27DNA改组技术DNA改组（DNAshuffling），又叫有性PCR（sexual-PCR）等，将单一基因随机片段化，这些片段自配对PCR扩增，由于易错PCR而引入大量随机突变，并在多次循环中重组，使基因在体外迅速进化，从中筛选到有益重组。优点：体外定向进化，快速，高效（蛋白质、酶、抗体等）DNA改组技术DNA改组（DNAshuffling），又叫28DNA改组技术DNA改组技术29蛋白质工程制药汇总课件30基因家族改组DNA改组的不足：从单一基因出发，得到的随机点突变率很低，且有益突变的积累相对缓慢在自然界中，不同物种同源基因本身就是具有非常丰富的变异，如果加以利用，就可以大大地加速基因在体外的进化速度——基因家族改组（DNAfamilyshuffling）基因家族改组DNA改组的不足：从单一基因出发，得到的随机点突31基因家族改组基因家族改组32蛋白质工程制药汇总课件33S3蛋白质工程制药实例蛋白质工程在新药研究中的应用胰岛素的蛋白质工程研究S3蛋白质工程制药实例蛋白质工程在新药研究中的应用34蛋白质工程在新药研究中的应用1、提高药效活性2、提高靶向性3、提高稳定性、改善药代动力学特性4、提高工业生产效率5、降低蛋白药物引起的免疫反应6、获得具有新功能的蛋白分子7、获得特定蛋白的拮抗物或类似物8、模拟原型蛋白分子结构开发小分子模拟肽类药物蛋白质工程在新药研究中的应用1、提高药效活性5、降低蛋白药物35胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病I型糖尿病：II型糖尿病：胰岛素抵抗（IR）为主，伴胰岛素相对缺乏；以及胰岛素分泌缺陷，伴IR由于细胞介导的胰岛B细胞自身免疫性破坏，导致胰岛素绝对缺乏胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药I型糖尿病：36胰岛素的蛋白质工程研究闭环系统：自调控竞争解吸附作用胰岛素的蛋白质工程研究闭环系统：自调控37胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病中国4000万，全球1.5亿患者急性并发症：

酮症酸中毒（I，昏迷、死亡）非酮症高渗性昏迷（II）低血糖反应（心慌、手抖、饥饿、出冷汗）胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药中国400038胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病中国4000万，全球1.5亿患者慢性并发症（可遍及全身各重要器官）：心血管疾病、慢性肾病视网膜病变、神经病变胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药中国400039胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药40胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药41胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素1982年，重组人胰岛素上市——第一个基因工程药物！第一个完成序列测定的蛋白质（1958年）第一个人工合成的蛋白质（1965年）Sanger

胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药第一个完成序42胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素每100L发酵液就能产生5g胰岛素，使其价格降低了30%-50%!提取4-5g胰岛素需要100Kg胰腺胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素是治疗糖尿病的特效药每100L发43胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素在临床应用时存在的问题1、在正常生理情况下胰岛素在体内是不断地分泌的，但不能连续不断地注射胰岛素2、皮下注射胰岛素时，吸收得也很慢，注射后1.5-2小时，体内胰岛素水平还未能达到高峰，这就会导致高血糖；3-5小时之后胰岛素水平仍在继续上升，这又会导致低血糖胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素在临床应用时存在的问题2、皮下注44胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素在临床应用时存在的问题3、糖尿病病人一般需要每日四次注射给药

胰岛素的蛋白质工程研究胰岛素在临床应用时存在的问题45胰岛素的蛋白质工程研究蛋白质工程技术对胰岛素的改造1970S初，英国的Hodgkin等、我国的梁栋材等，分别用X-射线晶体衍射法进行了高分辨率的三维结构分析，胰岛素的蛋白质工程研究奠定了基础胰岛素的蛋白质工程研究蛋白质工程技术对胰岛素的改造46胰岛素的蛋白质工程研究蛋白质工程技术对胰岛素的改造1、速效胰岛素（可快速吸收的单体胰岛素）2、长效胰岛素3、高效胰岛素（与受体亲和力增加的胰岛素突变体）胰岛素的蛋白质工程研究蛋白质工程技术对胰岛素的改造47速效胰岛素胰岛素吸收慢的原因：二聚体、六聚体速效胰岛素胰岛素吸收慢的原因：二聚体、六聚体48速效胰岛素3D分析发现：多聚体的形成与B8、B9、B12、B13、B16、B23-B28的氨基酸残基有关用蛋白质工程方法在多聚体接触面上某些氨基酸残基换上带负电的氨基酸残基B链Ser9

Asp（-），Thr27

Glu（-）由于相同电荷互斥，减少多聚体形成，吸收速度