流式细胞仪检测凋亡和细胞周期

流式细胞术FlowCytometry（FCM）什么是流式细胞仪●流式细胞仪实物BDFACSVantageBD-Calibur1.发展历史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述2.定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术.3.特点测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞可进行多参数测量在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。4.应用范围二、流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满鞘液，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。基本结构流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。

三、

流式细胞仪可检测到的细胞参数

非荧光信号颗粒度细胞大小前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性血液涂片外周全血细胞散射光双参数点图荧光信号荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。荧光信号与细胞特性

荧光染料被激发而发射的光信号。

定量染色荧光信号大小被标记组分含量的定量多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光光信号分离，导向各探测通道接收并转化为电信号。光信号收集三数据处理及流式报告FSCSSCFL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。GeoMean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。散点图密度图二维等高图直方图图报告中常见的几种流式细胞图图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死流式细胞仪数据分析点图分析流式细胞仪数据分析直方图分析图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞五、

流式细胞术的应用

细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……

细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位

……一）细胞DNA含量检测细胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。

单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N

2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体含量与凋亡关系DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究

1.肿瘤诊断DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体2.凋亡研究在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。AnnexinVAssay

图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

图FCM测试细胞周期分布和凋亡根据凋亡细胞的特点来检测在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC？SSC？细胞坏死时，细胞肿胀，FSC？，SSC？CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。三）淋巴细胞分类流式细胞术检测细胞表型

流式细胞术白血病免疫分型是利用