一人类外周血染色体标本制备一课件

实验一人类外周血染色体标本制备一、实验目的初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。二、实验原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960年发现外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

1三、实验步骤

１、采血（已完成）２、培养（lymphocytescellculture）（已完成）RPMI1640培养液，37℃

0.5℃恒温中培养72小时。3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。（已完成）

4、离心（centrifugalization）以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。

三、实验步骤2５、低渗处理（hypotonictreatment）加８毫升预温(37℃)的0.075MKCl低渗液（hypotonicsolution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。6、预固定（pre-fixation）低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，打匀。7、再离心1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。５、低渗处理（hypotonictreatment）6、预3８、固定(fixation)加入固定液（甲醇︰冰醋酸=3︰1）5ml，将沉淀打匀，固定20分钟。

９、再离心1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。10、再固定：加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰3），固定20分钟。８、固定(fixation)411、再离心1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。

12、再固定加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰1）打匀，固定20分钟。13、制片固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dirdrying）。11、再离心514、染色（Giemsastaining）

Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。

15、镜检（microscopicexamination）14、染色（Giemsastaining）6一人类外周血染色体标本制备一ppt课件7四、试剂和药品1、培养液的配制RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠)80％小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)20％植物血凝素PHA(主要成分是粘多糖和蛋白质)4％青霉素终浓度100单位/毫升链霉素终浓度100单位/毫升用3.5%NaHCO3调pH到7.0-7.2，玻璃滤器抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5毫升）。培养基置于-20℃冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至37℃。四、试剂和药品82、肝素（heparin）：浓度0.2％，200毫克肝素粉末溶于100毫升生理盐水中。高压灭菌，冰箱保存备用。3、秋水仙素：10微克/毫升，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称10毫克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中，配成100微克/毫升的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存。临用时取上述原液用生理盐水稀释成10微克/毫升。4、0.075MKCl：0.559克氯化钾溶于100毫升双蒸水中。5、甲醇（methanol）二者以不同比例配合使用6、冰醋酸（aceticglacid）新鲜配制2、肝素（heparin）：浓度0.2％，29７、吉姆沙染液（Giemsa）

吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。

1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液

８、磷酸缓冲液(pH6.8)溶液A：磷酸二氢钾(KH2PO4.2H2O)9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。溶液B：磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。７、吉姆沙染液（Giemsa）10五、注意事项1、采血接种培养时，注意加入适量的肝素。2、培养基中不含L-谷氨酰胺，则溶解有RPMI1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH值等于4，然后高压灭菌（注意121℃，15磅，灭菌15分钟）。冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗。3、接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。如果不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。五、注意事项114、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃

0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸，细胞发育不良，偏碱细胞会出现轻度固缩。5、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。6、培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。7、最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血128、培养失败的可能原因：

培养瓶等器材洗涤不合要求。

配制培养基溶液的二或三蒸水不合要求。