一种B细胞扩增用重组蛋白CD40L及其使用方法与流程

一种B细胞扩增用重组蛋白CD40L及其使用方法与流程引言B细胞免疫调节剂在治疗免疫性疾病和癌症方面有广泛的应用前景。其中可针对单一抗原的免疫疗法因其治疗效果特异性高而备受关注。选择适当高效的B细胞刺激因子，可以实现选择性扩增难以识别抗原特异性B细胞，从而增强免疫应答和治疗效果。例如，使用Cd40配体（CD40L）扩增已知的抗原特异性细胞对破骨细胞瘤或胃肠道肿瘤的免疫治疗效果显著提高。然而，野生型CD40L的使用有时会导致严重的副作用，包括T细胞介导的强烈免疫反应。为了克服这些问题，从人源化、CD40L的重组和优化的研究中，开发了用于选择性B细胞扩增的新型CD40L重组蛋白，可以更好地控制治疗剂量、减少副作用。本文将对一种B细胞扩增用重组蛋白CD40L及其使用方法与流程进行详细介绍。重组蛋白CD40L的构建人类CD40L蛋白全长域（aa2-261）从人源化基因中取出，克隆到温度敏感的大肠杆菌表达质粒pLV-TH并进行表达。CD40L蛋白的多聚体组装形式通过不同的表达条件进行了调节，在合适的热敏感诱导条件下表达后得到的部分可溶峰较高，表明形成了大量高分子量且高度聚合的CD40L多聚体。最终通过柱层析技术纯化出CD40L蛋白。CD40L蛋白经大规模表达纯化后，进行毒性、微生物学和质量分析，结果表明该蛋白的生物活性高、质量稳定，符合国际规范的制药级别、临床试验级别的标准。重组蛋白CD40L的结构特征CD40L是一种TNF家族成员，N端存在一个一个外泌蛋白域(ECTO)，可以参与糖基化作用，同时在跨链锚接外泌后的CD40L中共有334个氨基酸残基表现出了生物功能。可以通过这些区域与CD40发生交互。具体来说，这个蛋白的主要结构特征为单个蛋白分子是由两个独立单体的非常稳定的三聚体组成的。重组蛋白CD40L的结构基本上是围绕数肽（尤其是T51）和册激活结构（尤其是区域3，K191-R202）的相互作用维持的。在没有CD40的情况下，CD40L/K191-R202的区域可能存在（无法通过X射线晶体技术确定）。当CD40L和CD40（aa22-144）结合时，这些相互作用得到增强，CD40L-K196通过水桥接M近似与CD40-Y118的末端HC表面距离形成碱性极点极靠近的酸性东西，并且没有一水桥，水桥的热动力学性质可能对CD40L/CD40结合的增强起到重要作用。这个结构的揭示说明了重组蛋白CD40L与靶分子CD40的特异性相互作用，指导了重组蛋白CD40L的优化设计。重组蛋白CD40L使用的方法目前，主要应用于CD40L的治疗策略包括直接注射或基因工程B细胞等，从而实现对B细胞的选择性激活而非对整个免疫系统的刺激。用于CD40L治疗的最佳途径取决于特定疾病的治疗响应和对CD40L重组蛋白的生物学响应，以及需要治疗的特定细胞类型的可使用方法。重组蛋白CD40L的稳定性目前有一些研究表明，重组蛋白CD40L在99℃下可以稳定30min以上，且在冰冻和化学不和条件下也表现出较强的稳定性。相对于在37℃时失活较快的野生型CD40L，这个重组蛋白的稳定性大大提高了其临床应用的可能性。重组蛋白CD40L与细胞悬液的处理在扩增B细胞的过程中，操作人员应当先制备CD40L重组蛋白供使用。对于细胞处理，细胞从培养瓶内取出并离心，将异物和红细胞清除，并用缓冲液重悬细胞。这个缓冲液可以是简单MM，PBS或RPMI，但是MM是最好的选择。然后为每个实验制定一个不同的应用（固相或液相）。对于液相，将每个“通孔”装满细胞悬液。对于固相，将96孔板中的各通道涂上所需抗原。测常量建议使用固相法。不同类型细胞的扩增一般在液相法扩增过程中，会根据目标样本不同的来源选择合适的CD40L作为刺激剂。对于人类B细胞，较常用的是哺乳动物的重组CD40L；对于小鼠B细胞，目前多采用融合的鼠类有癌细胞作为发酵宿主的可溶性CD40L。对于B细胞样品的扩增，需要在细胞外液中加入CD40L。对于单纯的核酸展示库等项目，CD40L一般在液相条件下作为循环加入，在一小时之内完成扩增。对于B细胞分选项目，需要将CD40L添加到混合物中，可以使用滴定法进行处理，稀释CD40L后依次加入到混合物中。与一般已知的B细胞活化方法（如LPS或PHA）相比，CD40L在去髓皮化上更加特异，但是仍然需要保证相应的核酸展示库配合CD40L进行扩增。结论重组蛋白CD40L是一种非常稳定且结构优化的蛋白，具有广泛的临床应用前景。在使用CD40L扩增特定类型B细胞的过程中，需要根据不同类型的样本选择合适的CD40L