控制菌及螨类检查技术-药品中金黄色葡萄球菌检查

项目九控制菌检查及螨类检查技术任务8药品中金黄色葡萄球菌检查技能点4血浆凝固酶试验操作1.实训目的掌握血浆凝固酶试验操作程序及注意事项。2.实训要求2.1能按下达的任务要求，完成血浆凝固酶检查的试验设计。2.2能根据试验设计完成试验的准备及试验的具体操作。2.3能根据试验反应的结果做出正确的结论。

3.实验原理

血浆凝固酶是指能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔的血浆发生凝固的酶类物质。致病性葡萄球菌大多能产生凝固酶，非致病葡萄球菌不产生此酶。血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。血浆凝固酶试验操作4.实验材料

菌种：金黄色葡萄球菌（SA）、表皮葡萄球菌（SE）、兔血浆、生理盐水（备用）玻片

5.实验操作

取无菌试管(10mm×100mm)3支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1)0.5ml。其中1支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液)0.5ml。其余2支作对照管:1支加入金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]菌悬液和营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照；另1支加入营养肉汤和0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。3管同时置36℃±1℃水浴或恒温培养箱,3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜(动作勿大)，仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固状者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。

血浆凝固酶试验操作6.结果判断

如果革兰氏染色结果清晰可靠（必要时加做已知革兰染色结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验为阴性，阳性对照实验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理。6.1疑似菌革兰染色呈阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）6.2革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，成血浆凝固酶试验阴性反应，报告1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。6.3阴性对照试验有菌生长，试验结果无效。6.4阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌性。血浆凝固酶试验操作7.注意事项7.1金黄色葡萄球菌在上述两种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响成非典型菌体存在，亦可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查，以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影响色素产生，故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。7.2如果使用干燥培养基，应按说明书配制，注意pH是否符合规定，必要时应校正pH后灭菌使用7.3血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常析出)易导致假阴性反应。此外，观察结果时不要摇动试管，因凝固初期凝块易破坏，引起假阴性试验。血浆凝固酶试验操作项目九控制菌检查及螨类检查技术任务8药品中金黄色葡萄球菌检查知识点8药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.1金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及与外界相通的腔道中也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。

金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色镜检和血浆凝固酶试验等步骤进行。本法适用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。8.1.1形态特征

金黄色葡萄球菌菌体呈球形,直径0.5-1.5µm,平均直径0.8µm,菌体大小均匀一致.无鞭毛和芽孢,除及少数菌株外一般不形成荚膜。金黄色葡萄球菌菌体易被碱性染料着色，因此革兰染色呈阳性，但已衰老，死亡的菌体由于核酸含量降低等原因，被中性粒细胞吞噬后的菌体碱性染料就不易着色了，常呈革兰染色阴性。药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.1.2培养特征

金黄色葡萄球菌对营养条件要求不高，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.4，该菌耐盐性极强，在含有10%-15%氯化钠的培养基中仍可生长繁殖，可用于金黄色葡萄球菌的分离。金黄色葡萄球菌可产生脂溶性的金黄色色素，不溶于水，因此菌落着色，培养基不着色。本菌含有卵磷脂酶，可将卵磷脂分解而使菌落出现乳浊圈。8.1.3生化反应

金黄色葡萄球菌的生化活性很强，能分解萄葡糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等多种糖类，乳酸为其最终代谢产物，但不产气体；该菌甲基红反应和VP试验为+；靛基质试验-；尿素酶试验+；硝酸盐还原试验+；明胶液化试验+；甘露醇试验+；血浆凝固酶试验+；耐热性DNA酶试验+。

药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.1.4抵抗力

本菌抵抗力较强，干燥情况下能生存数月,80℃30min的条件下尚能存活,5%石炭酸或0.1%升汞溶液10-15mm,70%乙醇在数分钟内杀死该菌。本菌对青霉素敏感，但有抗性菌株，且日渐增多；对磺胺敏感性较低；对庆大霉素、头孢菌素较敏感；对红霉素、链霉素敏感；而对氯霉素敏感性较差。8.2检查程序供试液的制备见“药品中微生物总数的检查”。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性试验应检出相应的控制菌。阳性对照试验的目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。药品中金黄色葡萄球菌检查方法阴性对照试验：取稀释剂10ml加入100(或200m1)相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。阴性对照试验目的：检查稀释剂是否满足无菌要求及培养条件是否适宜。8.2.1增菌培养

取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3份，每份100ml,1份加入10ml供试液；1份加入供试液及阳性对照菌；1份加入与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为阴性对照，置36℃±1℃培养18-24h(必要时延至48h)，阴性对照应无菌生长。8.2.2分离培养

将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1-2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置36℃±1℃培养24-72h，当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表10-5所列特征，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。药品中金黄色葡萄球菌检查方法金黄色萄球菌在选择性培养基上菌落形态特征药品中金黄色葡萄球菌检查方法培养基菌落形态特征卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径1-2mm甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.7-1mm8.2.3纯培养

当供试品分离平板生长菌落与表10-5所列菌落特征相似或疑似时应速取2-3个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于琼脂斜面上，于36℃±1℃培养18-24h，取营养琼脂斜面培养物作革兰染色。镜检及接种于营养琼脂肉汤36℃±1℃培养18-24h，做血浆凝固酶试验。8.2.4革兰染色、镜检8.2.4.1革兰染色

见大肠埃希菌。8.2.4.2镜检金黄色葡萄球菌为革兰阴性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜，排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个，成双或短链状排列。药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.2.5血浆凝固酶试验

取无菌试管(10mm×100mm)3支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1)0.5ml。其中1支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液)0.5ml。其余2支作对照管:1支加入金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]菌悬液和营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照；另1支加入营养肉汤和0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。3管同时置36℃±1℃水浴或恒温培养箱,3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜(动作勿大)，仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固状者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.3结果判断

如果革兰氏染色结果清晰可靠（必要时加做已知革兰染色结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验为阴性，阳性对照实验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理。8.3.1疑似菌革兰染色呈阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）8.3.2革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，成血浆凝固酶试验阴性反应，报告1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。8.3.3阴性对照试验有菌生长，试验结果无效。8.3.4阳性对照试验呈阴性结果,应当加做验证试验,考察检品是否有抑菌性。药品中金黄色葡萄球菌检查方法8.4注意事项8.4.1金黄色葡萄球菌在上述两种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响成非典型菌体存在，亦可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验