奶油栓孔菌子实体多糖的化学性质及酒精性肝损伤的保护作用

奶油栓孔菌子实体多糖的化学性质及酒精性肝损伤的保护作用

酒精性肝病（ald）是由长期饮酒引起的肝脏损伤性疾病，包括从脂肪变质到肝硬化的广泛肝脏病变。奶油栓孔菌Trameteslactinea是隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、栓孔菌属Trametes的一种大型真菌，其子实体一年生，硬木栓质至木栓质，是我国热带地区一种常见的大型真菌（1材料和方法1.1材料、试剂和机器1.1.1tratelact三维培养奶油栓孔菌子实体采自福建省南平市浦城仙芝楼灵芝基地，经鉴定为奶油栓孔菌Trameteslactinea；昆明种小鼠40只，由吴氏实验动物在线提供（/xieli/），体重18–22g，雄性。1.1.2试剂和试剂盒1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）和抗坏血酸（VC）均为国产分析纯；联苯双酯滴丸由北京协和药厂提供；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；苏木素-伊红染液试剂盒由江苏凯基生物技术股份有限公司提供；UV-vis1800紫外可见分光光度计（岛津实验器材有限公司）；VarioskanFlash多功能酶标仪（美国Thermo公司）；NicoletiS50傅立叶变换红外光谱仪（美国Thermo公司）；BX43生物正置显微镜（日本Olympus公司）。1.2方法1.2.1分离纯化蛋白质将奶油栓孔菌子实体烘干后粉碎，取适量子实体粉末按料液比1:30加入去离子水，置90℃水浴锅中提取4h，重复提取2次，合并两次提取液，加入3倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，离心收集沉淀，用去离子水复溶，用Sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1）进行脱蛋白质直至无沉淀，离心取上清液。将多糖溶液装入透析袋中连续流水透析48h，除去小分子物质，将透析后的多糖溶液冻干，得到奶油栓孔菌子实体多糖（TLFPS）。1.2.2化学组成分析总糖含量采用苯酚-硫酸法（1.2.3紫外吸收光谱测定多糖样品配制成0.25mg/mL的溶液，利用紫外-可见分光光度计在190–300nm范围内扫描，扫描间距为1nm。1.2.5刚果红试验参考1.2.6活性测定DPPH自由基清除活性测定：参考AABTS自由基清除活性测定：参考A超氧阴离子自由基清除活性测定：超氧阴离子自由基清除能力测定参照A铁离子还原能力测定：参照1.2.7小鼠肝功能指标的测定动物分组和处理：将购买的40只雄性小鼠随机分成4组，每组10只，分别为空白组、模型组、多糖组（200mg/kgTLFPS）和阳性对照组（300mg/kg联苯双酯）。适应性喂养一周后，对照组和模型组小鼠灌喂蒸馏水，多糖组和阳性对照组小鼠按对应剂量灌喂给药8d，期间自由进食。参照小鼠的醉酒与醒酒时间测定：参考小鼠肝指数及其血清ALT、AST、TC、TG指标的测定：解剖前称量体重，解剖后称量肝脏总重，小鼠肝指数=肝脏总重/体重×100%，从小鼠眼球部位取血，经3500r/min离心后取上层血清备用，根据试剂盒说明书要求测定血清ALT、AST、TC、TG的水平。肝脏MDA、CAT、SOD指标的测定：称取小鼠肝组织制成10%的匀浆液，5000r/min离心，取上清液备用，根据MDA、CAT、SOD试剂盒说明书要求分别测定MDA、CAT、SOD的水平。肝组织病理学观察：取各组肝左叶中部切片用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染液试剂盒染色后，在200倍显微镜下进行观察并拍照。1.3数据的统计与分析数值用uf060x±s表示，数据分析采用SPSS20.0软件，P<0.05和P<0.01表示显著差异和极显著差异。2结果与分析2.1tlfps的化学成分分析比色法测定结果显示多糖含有较高糖醛酸含量和硫酸根含量，并且结合有微量蛋白质（表1）。2.2tlfps多糖类物质紫外-可见光谱扫描结果见图1，在195nm处有明显吸收峰，这是多糖的特征吸收峰，表明TLFPS属于多糖类物质。在280nm波长附近有微弱吸收峰，表明经脱蛋白处理后，仍有少量蛋白与多糖紧密结合（2.3tlfps红外光谱分析红外光谱分析结果显示，在3412.00cm2.4tlfps三螺旋结构分析刚果红能与具有三股螺旋构象的多糖形成络合物，与不加多糖的刚果红溶液相比最大吸收波长（λ2.5dpph、abts、铁离子还原能力本研究通过测定DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基的清除活性和铁离子还原能力来评价奶油栓孔菌子实体多糖（TLFPS）体外的抗氧化能力。DPPH的清除活性随多糖浓度的增加而增加，表现出良好的量效关系，当多糖浓度为4mg/mL时，DPPH的清除率达到了(79.64±0.37)%（图4A）。对ABTS的清除能力见图4B，当多糖浓度为1mg/mL时，ABTS的清除率达到了阳性对照VC的水平。随着多糖浓度的增加，超氧阴离子清除率平缓上升，在浓度为4mg/mL时，超氧阴离子的清除率达到(43.57±2.03)%（图4C）。对铁离子还原能力见图4D，其可以反映样品总的还原力，还原能力体现在FRAP值上，FRAP值越大还原能力越强。结果显示铁离子还原能力随多糖浓度增加呈剂量依赖性，当浓度为4mg/mL时，其FRAP值达到(0.50±0.003)mmol/L。综上所示，奶油栓孔菌子实体多糖作为一种天然产物具有较强的体外抗氧化能力，该结果为即将开展的体内生物活性实验奠定了良好的基础。2.6小鼠称重测定将提取纯化的子实体粗多糖用于急性酒精性肝损伤小鼠实验，在实验期间，每隔一天对各组实验小鼠进行称重。与空白组相比，模型组、多糖组以及阳性对照组的小鼠体重无显著性差异（P>0.05）（表2），这表明实验所用试剂剂量适当，对小鼠的生长发育不构成影响，同时也表明TLFPS对小鼠健康无影响，对小鼠无毒副作用。2.7tlfps对急性酒精肝脏损伤大鼠饮酒和饮酒时间的影响小鼠酒精中毒后会产生翻正反射现象，是检测小鼠酒精中毒的指标之一（2.8tlf有助于降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数肝指数可反映肝的病变情况，一旦肝脏受损就会导致肝指数发生明显变化（2.9小鼠血清中ast、alt、tg、tc的变化情况AST、ALT、TG和TC都是检测肝损伤的重要指标，当细胞损伤时血清中的含量会大量增长。对小鼠血清AST、ALT、TG和TC的研究见图6，与空白组相比，模型组小鼠血清中AST、ALT、TG和TC水平均显著提高（P<0.01），这说明小鼠肝细胞受到严重破坏，致使小鼠体内ALT、AST、TG和TC代谢平衡被破坏，大量进入血液中使得血液中的含量显著升高。与模型组相比，奶油栓孔菌子实体多糖能够明显地降低急性酒精肝损伤小鼠的AST(P<0.05）、ALT(P<0.01）、TG(P<0.01）和TC水平（P<0.01），结果反映出奶油栓孔菌子实体多糖对乙醇诱导的小鼠急性酒精性肝损伤有良好的缓解作用。2.10乙醇对小鼠肝脏抗氧化能力的影响MDA、SOD和CAT是检测肝损伤的重要指标，能反映机体肝组织的氧化损伤程度。对小鼠肝脏MDA、SOD和CAT的研究结果见图7，与空白组相比，模型组小鼠肝脏中MDA水平明显提高（P<0.01),SOD、CAT活性显著下降（P<0.01），表明给予乙醇会造成小鼠肝损伤，肝损伤小鼠抗氧化能力大幅度降低。与模型组相比，奶油栓孔菌子实体多糖能够明显地降低酒精肝损伤小鼠的肝MDA水平（P<0.01），提高SOD、CAT活性（P<0.05），表明奶油栓孔菌子实体多糖能够缓解酒精造成的氧化应激损伤，对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的预防保护作用。2.11窦无明显溶血在检测小鼠酒精性肝损伤指标以后，进一步观察不同组小鼠肝组织的变化情况。空白组（A）小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，呈放射状，肝细胞结构清晰，没有泡沫状改变，肝窦无明显充血。与空白组相比，模型组（B）小鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦变窄，肝细胞出现浊肿，泡沫或气球样改变，胞浆淡染，细胞核模糊不清。肝窦出现明显的充血现象。与模型组相比，多糖组（C）显著改善肝细胞浊肿及泡沫样改变，对肝细胞索紊乱有一定的改善作用，阳性对照组（D）肝细胞索排列明显改善，肝小叶界限明显，肝细胞浊肿及泡沫样改变明显改善，肝脏病理组织观察结果也说明了奶油栓孔菌子实体多糖（TLFPS）对急性酒精性肝损伤具有很好的预防效果，而阳性药也能达到该种程度的效果，甚至更佳（图8）。3tlfps的临床应用本研究通过比色法测得奶油栓孔菌子实体多糖有较高的糖醛酸含量(103.45±0.71)mg/g，研究表明多糖中糖醛酸含量越高，清除氧自由基的能力更强，抗氧化能力就越强（肝脏是人体最大的腺体器官，极易受有毒化学物质损伤，造成肝脏代谢功能紊乱。大量酒精摄入会导致脂肪肝、肝炎、肝硬化，目前肝损伤已成为了尤为突出的全球性健康问题（本研究以50%乙醇灌喂小鼠建立急性酒精性肝损伤模型，探究奶油栓孔菌子实体多糖（TLFPS）在体内对酒精性肝氧化损伤的保护效果。在健康肝脏中ALT、AST很高，而血液中含量很低，一旦肝脏细胞受损，大量ALT和AST就会释放到血清中使血清中含量升高，ALT与AST水平的高低在一定范围内反映机体肝细胞的损伤程度（