小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定

分子生物学试验报告一、试验时间20231121日10:00—17:30二、试验内容RNA的提取纯化与鉴定三、试验目的RNA提取的根本原理、应用及操作的留意RNA提取方法及其检测方法。四、试验原理：RNAcDNAcDNA文库Northern印迹RNA分光光度法进展定量。RNARNA酶分布广、活RNARNA降解。抑制RNARNA酶对RNA的降解。焦磷酸二乙酯〔DEPC〕RNA酶RNA酶的活性。DEPC是消退RNA0.1%DEPC处理试验器皿与试剂配制用水，根本可以消退外源RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用时肯定要留意。DEPC处理的器皿与水必需经高压灭菌处理，使DEPC分解前方能使用。值得留意的是，DEPC具有很强的反响性，能够与RNA在内的多种生物分子以及多种化学试剂作用，因此不能直RNA酶活性。RNARNA酶活性的主要方法。作为一种蛋白变性剂，异硫氰酸胍可导致包括RNARNA纯化过程中因尽可能去除异RNARNA的降解。RNARNA产生破坏。在这种状况下，最适宜的方法是RNARNA酶抑制剂本身是蛋白质，可RNARNA的逆转录以及体外翻译等过程均无干扰。RNADNA与蛋白质，最常用的方法是酸性DNARNA，同时酚又是蛋RNA的分别。最终利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总RNA。RNARNA其A

应处于6至8

RNA浓度呈正相关。RNARNA为单链分子，二级构造简单ARNA包含了三种主要组分，其中rRNA含量最高，因此在电泳18S28SrRNA的条带。如两条条带清楚，且亮度之比1:2，则说明RNA没有发生降解。一般状况下泳道前缘还可观看5S5.8SrRNAtRNA组较少且长度不均一，一般观看不到相应的条带。RNA18S与28SrRNARNA进展定量与RNA产物的浓度与含量。五、主要试验试剂与仪器 ：QIAGEN。20.1%DEPC12h，12115min，枯燥即可使用。3RNA0.1%DEPCSAGON，37℃12h，12115min。4、TrizolTakara公司。5、氯仿6、异丙醇7、75%乙醇，购自国药集团化学试剂。S〔H，乙酸钠，A〔。AM〔，溴酚蓝。六、试验方法与步骤：〔一〕RNA的抽提50~100mgTrizol1ml10分钟。12023rpm10min，取上清。参加氯仿0.2ml,猛烈震荡15s,4℃放置10min,12023rpm离心15min,三相，即上层的水相，下层的有机相以及中间的变性蛋白，留神吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。参加异丙醇℃放置m离心50%3上清液的体积相当。1ml75%8000rpm5min〔假设管壁仍有残留液体，连续离心，吸取残留液体〕乙醇洗涤的目的是去除沉淀中残留的盐分。沉淀空气枯燥溶解于ll℃保存备用。〔二〕紫外分光光度法测定纯度和含量承受nanodrop仪器测定RNAblank，1μl样品测定，读取数值。(三)RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测1×甲醛变性凝胶电泳缓冲液,10mlEB,混合均匀并灌制胶板。由于甲醛具有挥发性，不能直接加热，必需对凝胶单独加热溶化后参加。2μlRNA8μl,655分钟，快速冰浴冷却，点样。加热后快速冷却的目的是防止RNA复性。150V30分钟，紫外光下观看电泳结果。七、试验结果：紫外分光光度法检测浓度: 3883.5ng/μlA260：97.088A280：47.770260/280：2.03260/230：1.11电泳检测我的结果28s18s5s八、争论：nanodrop260/280=2.032.0，说明已有部RNA降解了。缘由可能有家氯仿萃取离心取上清时吸到了中层的RNA分解酶会分解RNA导致测量值偏高。260/230=1.11，说明有杂质，纯度不高，可能有蛋白质和胍盐残留，胍盐残留可能是乙醇洗涤不完全。RNADNA等污染，也有由于电极缓冲液配置问题，跑胶时，温度过高，导致效果较差的缘由。九、试验思考题 ：1RNA沉淀：DNA分子仍旧很大，溶液粘稠。变性的DNARNA，使之不能有效地释放到溶液中。2、RNA抽提率低的缘由：样品均化或裂解不完全:匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和DNA复合物包裹，不能被有效释放。RNA不完全溶解:RNA丧失。3、A260/A2801.652.0表示何意：1.65：TERNApH280nm处的光吸取值。TRIZOL量太少。分别的水样层中污染有苯酚层。RNA没有完全溶解。2.0：RNA因