高温高压湿法发酵产絮凝剂微生物菌种的分离和鉴定

高温高压湿法发酵产絮凝剂微生物菌种的分离和鉴定

微生物悬浮剂是微生物从微生物那里获得的具有诱导功能的次生代谢物。其结构和性能因生产冠状合金聚合金聚合金聚合物的细菌而异。本课题组前期从活性污泥中分离出一株能高产糖蛋白类絮凝剂的克雷伯氏菌NIII21材料和方法1.1种子液培养基的制备菌种:克雷伯氏菌NIII2课题组前期分离筛选、并保存制备种子液培养基:1L蒸馏水,牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,pH9.0。絮凝剂发酵培养基:1L蒸馏水,NaNO1.2实验方法1.2.1接种环的制备在无菌操作台上,紫外灭菌0.5h后,用接种环从保存NIII2菌的斜面上挑取适量,接种于100mL已高压灭菌后的种子液培养基中,恒温振荡器上,151r·min1.2.2添加总硫化合物niiii2的培养将絮凝剂发酵培养基高温高压湿法灭菌。无菌条件下,向100mL发酵产絮凝剂培养液中外加不同含量或不同种类硫物质并加入2mLNIII2种子液,151r·min1.3分析1.3.1微生物悬浮剂的产量测定根据1.2.2中提纯方法,絮凝剂冻干后称量,计算产量。1.3.2抗凝剂成分的测定苯酚-硫酸法测定提纯后的絮凝剂中糖含量1.3.3抗结合物测定取50mL2g·L式中:FR为絮凝率,%;a、b分别为样品和对照实验中所测定的OD1.3.4由于中阻剂zeta的电位和粒度分布的测定取约1mL50mg·L1.3.5微生物丙烯酸酯白色糖苷格的特征分析以将絮凝剂溶于0.2mol·L1.3.6红外光谱分析取约20mg提纯后的微生物絮凝剂固体,与KBr混匀压片后,使用傅里叶红外光谱分析仪(IRPrestige-21,日本岛津出品)测定红外光谱。2结果与讨论2.1硫含量对ni-iii2菌分散性的影响按照1.2.1、1.2.2中的方法进行实验,当发酵培养基中无外加或加极少量硫时,发酵过程易产酸性物质,72h发酵液pH从初值7.50降至5.38,NI-II2菌基本不分泌黄色(前期发现分泌黄色是该菌高产絮凝剂的标志),而发酵液澄清,无粘度。发酵液中分别加入一定量硫代硫酸钠和硫酸钠,培养72h,随硫含量增加,发酵液黄色逐渐加深,pH保持不变或略有升高,发酵液粘稠。而以硫化钠为外加硫源,NIII2菌基本不分泌黄色,明显产酸,pH值快速下降,如图1所示。与课题组前期研究按1.1.1中方法,以20g·L2.2硫有机物质对克莱氏菌nii2发酵聚吡咯烷结构的影响2.2.1含硫含量对总基和二硫键的影响按1.3.2中方法分别测定絮凝剂中蛋白质与糖的含量,并计算蛋白质与糖含量的比值,结果如图2所示。由图2结果看,无外加含硫无机物时,NIII2所产絮凝剂蛋白含量为13.22%,糖含量为60.25%,蛋白质与糖含量比值为0.22。投加硫代硫酸钠和硫酸钠体系中,随硫含量增加,絮凝剂中蛋白质含量增大,糖含量则降低,当含硫量16mg·L按1.3.2中方法测定蛋白质中二硫键。测定总巯基时,需先利用亚硫酸钠使二硫键裂解,pH值大于9,巯基与NTSB反应,生成黄色物质NTB和硫代磺酸钠。扣除原游离巯基后,结果如图3所示。由图3结果看,培养基中无机硫含量不但对絮凝剂中蛋白质含量有影响,也对蛋白质中总巯基和二硫键含量有很大影响。当未外加硫时,总巯基与二硫键含量都比较低,且二硫键所占总巯基比值也很低,为0.23。外加3种无机含硫化合物,当含硫量4mg·L2.2.2絮凝活性测定将图3所得絮凝剂按1.3.3和1.3.4中方法分别测定絮凝活性和Zeta电位,NIII2所产絮凝剂为糖蛋白,在水溶液中因水解而带负电荷。将絮凝剂配成50mg·L2.2.3含硫无机物对niiii2菌所产絮凝剂粒径分布的影响按1.3.4中方法测定絮凝剂粒径分布,结果如图5所示。由图5结果看,未外加无机硫化合物时,NIII2菌所产絮凝剂集中分布在两个范围内,0.452~1.385μm粒径絮凝剂占74.9%和1.386~2.423μm粒径絮凝剂占25.1%,而投加硫量达16mg·L2.2.4所产絮凝剂红外光谱NIII2菌株所产絮凝剂为糖蛋白,根据文献按1.3.6中方法测定所产絮凝剂的红外光谱,结果如图7所示。由图7结果看,波数为3430cm按文献[24]中方法,计算各峰面积,并计算~3430cm3含硫化合物的影响采用蔗糖为碳源,硝酸钠为氮源,初始pH为7.50等前期