二液相色谱方法建立和优化课件

液相色谱的应用以及方法开发

戴安中国有限公司1液相色谱的应用以及方法开发提纲：一.HPLC的广泛应用二.方法开发过程1）选择HPLC检测器2）选择色谱柱3）常用流动相4）方法开发的具体步骤5）梯度洗脱方法2提纲：一.HPLC的广泛应用2一.HPLC的广泛应用据2004年统计，世界上化合物总数多达4700多万种在全部有机化合物中仅有20％左右的样品适用于GC分析而HPLC可对80％左右的有机化合物进行分离和分析3一.HPLC的广泛应用据2004年统计，世界上化合物总数多HPLC的广泛应用HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。4HPLC的广泛应用HPLC特别适用于高沸点、大分子、强HPLC的应用领域在食品研究中的分析应用食品中的天然成分类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇碳水化合物脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素〕维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素〕农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸5HPLC的应用领域在食品研究中的分析应用5HPLC的应用领域

在医药研究中分析应用药物分析有USP、BP、CP等标准

常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。

在兽药研究中分析应用

6HPLC的应用领域在医药研究中分析应用6HPLC的应用领域在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)

在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品7HPLC的应用领域在生物化学和生物工程中的应用7HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒药物、毒品分析等在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类、胺类和二恶瑛的检测

在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析

8HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析：在无机离子分析二.方法开发的过程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到样品信息，确定分离目标2.确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求3.选择合适的检测器4.选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件5.优化分离条件6.检查特定过程的问题及需要7.定量校正8.日常使用的确认9二.方法开发的过程Adaptedfrom:Snyder第一步干什么?想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---仪器制造商的文献，如Dionex,Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品10第一步干什么?想办法得到各种信息10分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?11分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高?11分离(制备)时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?12分离(制备)时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）13使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同?13一个完整的方法包括流动相类型色谱柱及柱温流速检测器进样量运行程序梯度方法等度方法14一个完整的方法包括流动相类型14液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法，亦称色谱条件15液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数15一个完整的方法举例色谱柱AcclaimPAC16，120A，4.6*150mm*5μm(S/N00148)at30ºC流动相A25mMKH2PO4，pH3.5(用5%H3PO4调节)流动相BACN流速1.0mL/min检测波长210nm进样量5μL梯度Time(min)015.017.017.518.0B%0206010010016一个完整的方法举例色谱柱AcclaimPAC161）选择HPLC检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（选择型）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）整体性质检测器（通用型）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）171）选择HPLC检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的选择液相色谱的检测器通用检测器 RIELSD MS灵敏度 ug ng pg 线性范围 104 否 103流速敏感 是 否 是温度敏感 是 否 否破坏性 否 是 是选择性检测器 ABS FL ECCond MS灵敏度 ng pg fg pg pg线性范围 105 103 106 105 103流速敏感 否 否 是 是 是温度敏感 否 否 是 是 是破坏性 否 否 是 否 是18选择液相色谱的检测器通用检测器 RIELS理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略基线噪音宽的线性范围对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性19理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略基线噪音19灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1NS20灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比选择液相色谱的检测器要考虑的因素：

你要分离的化合物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度灵敏度需求是否有双检测的需求21选择液相色谱的检测器要考虑的因素：21吸光度（UV/Vis）检测原理原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A＝KCL优点：1）对温度和流速不敏感2）可用于梯度洗脱3）灵敏度较高，ng级检测缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质22吸光度（UV/Vis）检测原理原理：基于被分析组分对特定波吸光度（UV/Vis）检测的应用大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器

--多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA）23吸光度（UV/Vis）检测的应用大多数有机化合物有一定程度光电二极管矩阵（PhotoDiodeArray）PhotoDiodeArray简称：PDA或DAD24光电二极管矩阵（PhotoDiodeArray）Pho光电二极管矩阵检测器（PDA）的特点和用途

一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息在收集色谱图的同时，得到光谱图提供许多有用的功能-色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认-可以发现单波长检测时未测到的峰-任意波长的色谱再处理-光谱信息-光谱库的建立检索和拟合

25光电二极管矩阵检测器（PDA）的特点和用途一种三维水平荧光（Fluorescence）检测原理

原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象即荧光优点：荧光检测器灵敏度高,pg级检测缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生

26荧光（Fluorescence）检测原理26荧光检测器原理27荧光检测器原理27荧光检测器的应用环境中的污染物多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、饮料食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药氨基甲酸酯类杀虫剂黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素28荧光检测器的应用环境中的污染物氨基甲酸酯类杀虫剂黄曲霉毒素示差折光（RefractiveIndex）检测示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质－非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值RS29示差折光（RefractiveIndex）检测示差折光检测示差折光（RI）检测的原理原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度变化敏感2）不能用于梯度检测3）灵敏度低，ug级检测返回30示差折光（RI）检测的原理原理：连续测定流通池中溶示差检测器的应用示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化31示差检测器的应用示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的蒸发光散射（ELSD）原理用氮气把流动相吹成细雾状流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉蒸发的溶剂被从检测器中除去溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集PMT的输出与溶质的存在量呈比

例关系32蒸发光散射（ELSD）原理用氮气把流动相吹成细雾状32ELSD－优点及应用领域通用型－比流动相挥发性小的物质都能被检测可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相应用领域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制药行业表面活性剂天然产物33ELSD－优点及应用领域通用型－比流动相挥发性小的物ELSD－缺点不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）要求使用雾化气源（典型的是氮气或空气）不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化破坏性技术蒸发出的溶剂要引到户外或通风橱里对挥发性化合物的检测不理想一般得到的是非线性校正曲线某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器34ELSD－缺点不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）32）色谱柱选择色谱柱类型C18、C8、苯基、内嵌极性基团等硅胶、氨基柱、氰基、乙二醇柱等特殊色谱柱：手性色谱柱、凝胶柱、离子交换柱等规格长度、内径、粒径、孔径等品牌、批号Acclaim系列、Zorbax系列、Atlantis系列、国产色谱柱等352）色谱柱选择色谱柱类型35Acclaim1205µmC18品牌B品牌A0246810123423412341MinutesColumn: 如图所示Eluant: 90%MeOH Flowrate: 1mL/minTemperature: 30ºC

Peaks: 1.

2.

3.

4. 不同品牌C18区别36Acclaim1205µmC18品牌B品牌A02色谱柱: 如色谱图,5-µm规格: 150mmx4.6mm流动相: CH3CN/25mmol/L磷酸盐,pH3.3

(60/40v/v)温度: 30ºC流速: 1mL/min进样量: 5µL检测: UV,206nm不同类型色谱选择性差异0246810123465123456Acclaim

C18

AcclaimPA2MinutesAU峰:1.尿嘧啶 7.5μg/mL

2.嘧啶 503.苯酚 504.N,N-二甲基苯胺 505.甲苯 606.4-丁基苯甲酸 5037色谱柱: 如色谱图,5-µm不同类型色谱选择性差异02463）反相色谱及流动相反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离反相色谱的固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多，约占60-70%洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱383）反相色谱及流动相反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离3流动相极性39流动相极性39流动相洗脱强度反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇**应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法40流动相洗脱强度40流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大化学性质稳定，不损坏柱子不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收*黏度低，流动性好*无毒或低毒，易于操作易于从其中回收样品易于制成高纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境41流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大41常用流动相反相体系有机相：ACN、MeOH等水相：H2O、磷酸缓冲盐(pH2、7、12)、醋酸缓冲盐(pH4.5)、硼酸缓冲盐(pH9、13)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH8)等改性剂：三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)等正相体系正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等乙醇、异丙醇等42常用流动相反相体系42缓冲盐的选择缓冲盐类型挥发性：TFA、醋酸盐、甲酸盐、TEA等非挥发性：磷酸盐、硼酸盐等离子强度弱极性化合物分离：0~10mM中、高极性化合物分离：20~30mM离子交换：60~100mMpH值43缓冲盐的选择缓冲盐类型430,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,5010203040500,00,51,01,52,02,53,03,501020304050pH5pH6pH7pH8pH4T=40°C,F=1mL/minACN/20mMPhosphatebuffer/H2O35/35/30v/v/vmAUt[min]44流动相pH对分析的影响440,00,51,01,52,02,53,03,5010203MeOHvs.ACN3.003.504.004.505.00-100250600Absorbance[mAU]RetentionTime[min]13.003.504.004.505.00-50250550Absorbance[mAU]RetentionTime[min]21212MPB：MeOHMPB：ACN峰1---邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)；峰2---邻苯二甲酸丁酯(DBP)压力：MeOH-132bar；ACN-76bar；ACN洗脱能力更强；ACN选择性更好45MeOHvs.ACN3.003.504.004.505.系统压力与流动相粘度直接有关25oC20oC粘度曲线46系统压力与流动相粘度直接有关25oC20oC粘度曲线46流动相比例14.06.08.010.012.014.016.018.020.0-10501002Absorbance[mAU]RetentionTime[min]2WVL:210n531+265437ACN：H2O=30：70ACN：H2O=40：60有机相比例增加，出峰更快、压力不同、选择性不同47流动相比例14.06.08.010.012.014.016.流速对分析结果的影响01503004500150300450015030045001503004500123401503004503mL/min2.5mL/min2mL/min1.5mL/minTime[min]1mL/minC5C4C1C2C3Uracil01234012340123401234流速增加，出峰更早，一般选择性不变48流速对分析结果的影响01503004500150300450051015202530ºC123+456+7051015202540ºCt[min]2461357051015202521ºC1723456柱温对分析结果的影响柱温增加，出峰更早，选择性变化49051015202530ºC123+456+705101524）方法开发的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k’值改变保留值调节a值改变选择性通过改变流动相的pH值，使样品成中性加入“对离子”，使样品呈中性调节柱长度改变柱效及分离速度504）方法开发的具体步骤先用一根短的色谱柱50反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件∶色谱柱：C18，4.6mm×15mm流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：1ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)51反相色谱的方法开发开发过程实例51改变容量因子K’谱图52改变容量因子K’谱图52同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值改变色谱柱调节α值改变选择性53同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值调节α值改变选择性53离子型化合物的色谱分离离子型化合物的分离方式多数化合物是离子型的！使用离子交换柱：离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性54离子型化合物的色谱分离离子型化合物的分离方式54离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品成中性适用于弱酸性化合物的分离加入TFA,磷酸盐等降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内55离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留55离子抑制色谱实例而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。对甲氧基苯甲酸苯甲酸纳苯甲醛三甲氧基-四羟基苯甲醛56离子抑制色谱实例而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间流动相缓冲液pH值从pH4.95到pH4.45递减时，氨基酸衍生物的保留和分离呈2种变化趋势

57流动相缓冲液pH值从pH4.95到pH4.45递减时，氨离子抑制色谱的使用范围下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法使用“离子对色谱法” 58离子抑制色谱的使用范围下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型季铵盐、叔胺盐（正离子），适用于弱酸烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同59离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂59离子对反相HPLC分离强酸和强碱SO3SO3NRRRH+Na+键合相离子对试剂样品N+N+OCROH2PO4用烷基磺酸盐分离碱三氟乙酸(TFA)七氟丁酸(HFTBA)己烷磺酸用季胺烷基三乙基胺分离酸三乙胺(TEA)磷酸四甲基铵(TMA)磷酸四丁基铵(TBA)乙酸三乙基铵(TEAA)壬胺60离子对反相HPLC分离强酸和强碱SO3SO3NRRRH+

抗组胺及减充血剂药物的分析离子对色谱的应用61抗组胺及减充血剂药物的分析离子对色谱的应用6108年问题奶粉中三聚氰胺---8.5mg/kg

25cmC8柱PH4.1离子对试剂缓冲液:2.10克柠檬酸+2.16克辛烷磺酸纳/升（PH=3.0）；1ml/min；90/10=缓冲液/乙腈;240nm6208年问题奶粉中三聚氰胺---8.5mg/kg

25cmC809年奶粉中三聚氰胺---0.18mg/kg

25cmC8柱PH4.1离子对试剂缓冲液:2.10克柠檬酸+2.16克辛烷磺酸纳/升（PH=3.0）；1ml/min；90/10=缓冲液/乙腈;240nm6309年奶粉中三聚氰胺---0.18mg/kg

25cmC8方法开发的其他因素流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度64方法开发的其他因素流速对柱效的影响64色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速65色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱656666分析方法快速转换67分析方法快速转换67PhenylalkaneC1-C5,UracilProntosil120-C18-AQ80/20(v/v)ACN/H2O

1mL/min,20°C10µl,254nm-50050100150200250300350400450mAU0123456789101112131415C5C4C1C2C3UracilTime[min]50x4.6mm,dp=3µm0123456789101112131415C5C4C1C2C3Uracil125x4.6mm,dp=5µm-50050100150200250300350400450mAU0123456789101112131415C5C4C1C2C3Uracil250x4.6mm,dp=10µm-50050100150200250300350400450mAU快速分离－短柱、微粒填料15/08/20236868PhenylalkaneC1-C5,Uracil5）液相色谱方法开发

梯度洗脱方法695）液相色谱方法开发6液相色谱泵稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑滞后体积梯度分析更为关注目的：在任何情况下保持最高精度70液相色谱泵稳定平滑并且重现性好的流速70梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度71梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度71梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器72梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为1~4ml（戴安的4元泵<700µl，高压泵<400µl）73梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟73色谱柱反压变化对梯度实验的影响P680ALPGwithoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5µm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5µLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient