假酸浆毛状根黄酮提取工艺优化及其抑菌活性研究

假酸浆毛状根黄酮提取工艺优化及其抑菌活性研究

张帅，吕宏佳，李婧菲，赵雪(吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101)0引言假酸浆又名草本酸木瓜，为茄科一年生草本植物，广泛栽培在我国云南、广西等地[1-2]。其全草入药，主要功效有解毒、清热退火、吐痰止咳等，可治疗发热、热淋、癫痫、疮疖等疾病[3-4]。毛状根是由完整的植物或由植物中某一部分受到发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染后所产生的一种病理现象[5]，利用发根农杆菌诱导出来的毛状根中所含的次生代谢产物和自然生长的植物中有相同之处，更有些被诱导出的毛状根所含有的次生代谢物成分超过原植物[6]。黄酮类化合物是植物的一种次级代谢产物，广泛存在自然界中，常用作抗菌剂、抗氧化剂和感光剂等，具有抗老化、调血脂、降血压等保健功能，已成为医药和食品中天然抗氧化剂的开发目标[7-8]。但目前对毛状根中黄酮的提取率普遍不高，提高毛状根中黄酮的提取率是进行黄酮产品开发需要解决的问题。近些年，细菌的耐药性现象日益严重，黄酮作为天然产物之一，其抗菌性能也备受关注[9]。分析了假酸浆植物诱导出的毛状根中黄酮类化合提取工艺的优化，并对其抑菌作用进行评价，为提取毛状根中黄酮类化合物提供参考依据。1材料与方法1.1材料和试剂假酸浆无菌苗，假酸浆毛状根，发根农杆菌菌株A4。芦丁标准品，Cef(头孢噻肟钠)溶液，氢氧化钠，硝酸铝，无水乙醇，98%浓硫酸，苯酚试剂，蒸馏水。1.2仪器设备电热恒温培养箱BPX-272，光照培养箱SPX-300B-G，超声仪器KQ-400KDE，立式双层智能精密型摇床BSD-YX(F)3200，单人单面垂直净化工作台VS-840-1，电子天平BSA124S-cw，UV-5100型紫外可见分光光度计。1.3实验方法1.3.1假酸浆毛状根的诱导与培养取假酸浆无菌苗在无菌环境中剪下其茎段(1cm左右)放置于MS固体培养基上，预培养2d。在无菌环境灭菌的锥形瓶中倒入活化好的发根农杆菌菌液，将预培养好的假酸浆茎段放置于菌液内，侵染6min。取出被侵染的茎段，放置于无菌滤纸上，吸干表面上的菌液，将被侵染的茎段放置于MS固体培养基上，实行共培养4d。将共培养好的茎段取出，放置于(含有50mg/L青霉素)MS固体培养基上培养，此后每6d转接一次，直至长出毛状根后逐渐降低培养基中抗生素浓度进行培养，培养到25d时统计毛状根数量，在无菌环境中建立毛状根离体培养体系。1.3.2液体培养基的筛选在无菌环境中，剪取0.2g(鲜重)毛状根，分别放入含有20mLMS、White和N6(不含激素)的三种液体培养基中进行增殖培养，培养温度设置为25℃，摇床转速设置为170r/min。避光培养，待生长6d、12d、18d、24d时测增殖数，筛选出最佳液体培养基。增长倍数=(收获后鲜重-接种鲜重)/接种鲜重。1.3.3提取毛状根总黄酮含量假酸浆毛状根样品的制备。将培养后的假酸浆毛状根从液体培养基取出，用无菌水反复冲洗3次，后置于烘干箱低温(40℃)烘干，用研钵将干燥的毛状根研磨成粉末，密封保存备用。毛状根中黄酮的提取。准确称取2g研磨后的假酸浆毛状根粉末，以乙醇为溶剂，采取超声提取法(功率为220W)提取毛状根中的黄酮。标准品溶液的制备。称取3mg芦丁对照品置容量瓶中，加入浓度为70%乙醇30mL进行溶解。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。芦丁标准品标准曲线的制备。用移液管分别吸取对照品溶液0.0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别放入10mL容量瓶中，每个容量瓶内加入0.4mL硝酸钠、0.4mL硝酸铝和4mL氢氧化钠，用70%乙醇定容至刻度，混合摇匀，在510nm波长处测定吸光度，根据测出的吸光度值绘制标准曲线。结果计算得标准回归方程Y=2.8229X-0.0019，R2=0.9991，在0.01～0.05mg/mL内呈良好的线性关系，结果如图1所示。图1芦丁标准曲线Fig.1Standardcurveofrutin1.3.4单因素试验乙醇浓度对毛状根黄酮提取率的影响。称取干燥的毛状根粉末2.0g，按1∶20料液比，用浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇与毛状根粉末混合作为提取液，提取温度设置为50℃，超声时间设置为30min，超声波功率设置为220W，检测黄酮提取率。提取温度对毛状根黄酮提取率的影响。称取研磨后毛状根粉末2.0g，与70%乙醇溶液混匀，超声功率220W，料液比为1∶20，提取时间30min，设置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的温度进行超声波辅助提取试验，对比黄酮提取率。料液比对毛状根黄酮提取率的影响。称取研磨后毛状根粉末2.0g，加入到装有70%乙醇溶液的容量瓶中，超声功率220W，温度60℃，时间40min，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，进行超声波辅助提取试验，对比黄酮提取率。提取时间对毛状根黄酮提取率的影响。称取毛状根粉末2.0g，与70%乙醇溶液混匀，220W超声功率、60℃提取温度，1∶20料液比，时间分别采用10min、20min、30min、40min、50min、60min进行超声波辅助提取试验，对比黄酮提取率。1.3.5假酸浆毛状根中黄酮抑菌作用研究超声提取出的黄酮提取液稀释成浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液备用。采用纸片扩散法，准确吸取0.1mL在LB培养基中活化好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将其分别接种在PDA培养皿中，用灭菌后的接菌针均匀涂布，密封后置于28℃恒温培养箱内，培养48h。以1%头孢曲松钠为阳性对照，分别放入直径5.0mm的无菌滤纸片浸泡，无菌水为阴性对照。将滤纸剪成直径为1cm左右的小圆片，放置到5种不同浓度的黄酮溶液中浸泡，小滤纸片全部吸上液体后取出，把小滤纸片放置到供试菌株培养基表面，取3个滤纸片置于每个培养皿中，分别为头孢曲松钠(阳性对照)、阴性对照液和供试液，记好标识，37℃培养箱中培养17h，取出培养皿，测抑菌圈直径，作好记录。2结果与分析2.1毛状根增殖液体培养基的筛选结果由图2可见，当毛状根在MS液体培养基中生长，能促使其增殖量最多，其次培养基为N6，White培养基增殖量最少。当培养时间到24d时，毛状根的增殖量最多，最高增殖量为接种量23.7倍。图2培养基对毛状根生长的影响Fig.2Effectofmediumonthegrowthofhairyroot2.2单因素对毛状根中黄酮提取率的影响2.2.1乙醇浓度对毛状根黄酮提取率的影响如图3所示，当乙醇浓度范围在50%～90%时，毛状根中黄酮提取率先是逐渐增加，当达到最高量后开始出现下降趋势，提取率最佳状态是乙醇浓度为70%时，测得毛状根中黄酮得率为8.2%。图3乙醇浓度对黄酮提取得率的影响Fig.3Effectsofethanolconcentrationonextractionofflavones2.2.2提取温度对毛状根总黄酮提取率的影响如图4所示，超声浸提毛状根中黄酮量，伴随着温度升高，黄酮含量呈先增后减趋势，提取温度升高到60℃时，毛状根中黄酮的提取率最高，毛状根中黄酮得率为7.8%。图4提取温度对黄酮提取得率的影响Fig.4Effectsoftemperatureonextractionrateofflavones2.2.3料液比对毛状根中黄酮提取率的影响由于乙醇是挥发性溶剂，溶剂量的增加使黄酮被稀释，黄酮在溶剂挥发过程中遭受损失，反而提高了杂质成分的溶出。由图5可知，随着料液比例逐渐的增大，毛状根中黄酮提取率呈现逐渐上升而后下降状态，在料液比1∶20时，毛状根中黄酮的提取率最高，毛状根中黄酮得率为8.3%。图5液料比对异黄酮提取得率的影响Fig.5Effectsofratioofliquidtosolidonextractionofflavones2.2.4提取时间对黄酮提取率的影响黄酮提取率还与提取时间有很大关系，时间太短没能将黄酮类化合物提取出来，时间过长则易溶出其他杂质。如图6所示，毛状根中黄酮得率随着提取时间的增加而逐渐增高，当到达40min后，呈现明显下降趋势，所以最佳提取时间为40min。图6制取时间对黄酮提取得率的影响Fig.6Effectsofpreparationtimeonextractionyieldofflavonoids2.3假酸浆毛状根中黄酮的抑菌效果如表1所示，毛状根中提取出的黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，黄酮浓度在0.05%时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有起到作用；黄酮浓度在0.1%时，只对金黄色葡萄球菌起到抑菌作用；当黄酮浓度分别在1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL时，对以上两种菌均有抑菌作用，且随着黄酮的浓度增加，抑菌效果更明显。表1不同浓度黄酮的抑菌效果Tab.1Antibacterialeffectsofdifferentconcentrationsofflavones3结论长期以来，人们不断从植物中获取大量的次生代谢产物应于医药卫生方面。在单因素试验的基础上，对使用由发根农杆菌诱导出的假酸浆毛状根中总黄酮的提取工艺参数进行优化，结果表明，利用超声提取假酸浆毛