肿瘤标志物课件

张鹏主任技师天津医科大学肿瘤医院肿瘤标志物简介及临床应用1医学课件张鹏主任技师天津医科大学肿瘤医院肿瘤标志物人体癌症地图2医学课件人体癌症地图2医学课件

在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成、释放、或者是宿主对肿瘤反应产生的一类生化物质

在血液、体液及组织中肿瘤标志物的定量或定性检测可以作为肿瘤筛查（仅AFP与PSA用于高危人群）、鉴别诊断、治疗后病情监测及预后判断的标志与依据肿瘤标志物【tumormarkersTM】3医学课件在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合肿瘤标志物【tum肿瘤标志物应用的一般准则

是大分子物质(多为糖蛋白或脂蛋白成分),其在外周血和/或其他体液中的表达和浓度变化与恶性肿瘤的发生、发展关系密切

在肿瘤细胞表面或肿瘤细胞内合成，或通过其它细胞诱导而成

用于诊断的“理想标志物”应具备：仅在细胞恶变后才产生、分泌到血中，浓度可达被检测到；一经检测即可知肿瘤发生的部位4医学课件肿瘤标志物应用的一般准则是大分子物质(多为糖蛋白或脂蛋白成目前临床应用肿瘤标志物现状理想形式特异性100%真阴性100%假阳性0%健康人临界值敏感性100%真阳性100%假阴性0%肿瘤患者实际状况假阴性假阳性临界值敏感性100%特异性-60%健康人肿瘤患者特异性100%敏感性-50%敏感性上升特异性上升肿瘤标志物参数在健康人和肿瘤患者两组人群间的区别实际状态：假阴性和假阳性在选择临界值中的作用：特异性越高，敏感性越低，反之亦然5医学课件目前临床应用肿瘤标志物现状理想形式特异性100%健康人临界值肿瘤标志物检测质量标准

TM的诊断数值取决于其敏感性和特异性

TM的特异性是：在健康人或良性疾病患者所检测到的真阴性结果发生率，即假阳性结果百分率越低，特异性越好

TM的敏感率是肿瘤患者检测阳性结果的百分率46医学课件肿瘤标志物检测质量标准TM的诊断数值取决于其敏感性和特异TM敏感性和特异性在诊断上的意义

关键依赖于肿瘤分期和对照组的选择，只有肿瘤分期确定后，敏感性的数据才是可靠的

只有对照组有明确限定特征，其特异性才有意义

目前研究结果不仅是特异性和敏感性，还应指出群体研究中的个体结果以及普遍的分类7医学课件TM敏感性和特异性在诊断上的意义关键依赖于肿瘤分期和对照组TM的临界值设定原则

临界值是指某一TM在正常人或良性疾病患者中的假定上限值

临界值无固定数值，可随试验的目的而改变；鉴定尽可能多的肿瘤患者，降低临界值以增加其敏感性（假阳性

，特异性）

最大可能地指示出肿瘤发生，临界值可设定得高些，以增加其特异性（假阴性，敏感性）

TM的诊断价值很大程度上取决于临界值的选择；

在相对于健康人和良性疾病患者特异性为95%的临界值水平上比较其数据，可提高此TM的敏感性8医学课件TM的临界值设定原则临界值是指某一TM在正常人或良性疾病患特异性、敏感性及阴性和阳性预期值定义特异性=真阴性结果数真阴性结果数+假阳性结果数敏感性=真阴性结果数真阳性结果数+假阴性结果数阳性预期值=真阳性结果数真阳性结果数+假阳性结果数阴性预期值=真阴性结果数真阴性结果数+假阴性结果数9医学课件特异性、敏感性及阴性和阳性预期值定义特异性=真阴性结果数真阴临床实验室选用肿瘤标志物试验的要求

可靠性和重复性

批内变异＜5%

批间变异＜10%

宽分析范围

合理收费和减轻工作人员负担

高特异性＞95%

高敏感性＞50%

最佳阳性和阴性预期值（PV）

与肿瘤大小的相关性

本地区适合的试剂和批号敏感性（%）特异性（%）10080-60-40-20-0100806040200标志A标志B两条ROC（接受器工作特性）曲线，A在对照组和恶性肿瘤之间分布好，B不能进行分布10医学课件临床实验室选用肿瘤标志物试验的要求可靠性和重复性敏感性（%肿瘤胚胎性抗原甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）异位激素绒毛膜促性腺激素（HCG）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、降钙素酶和同工酶乳酸脱氢酶（LDH）神经元特异性烯醇化酶（NSE）前列腺酸性磷酸酶（PAP）血浆蛋白β2—巨球蛋白（PsM）细胞代谢产物脂质相关涎酸肿瘤抗原CAl9—9、CAl25癌基因和抑癌基因蛋白产物c—myc、ras、p53、Rb微量元素砷、铜、铁、硒、锌肿瘤标志物分类11医学课件肿瘤胚胎性抗原甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（C生化特性：糖蛋白，45~60%糖，电泳迁移率，6个抗原决定基分子量：180,000发生部位：胚胎及胎儿肠黏膜参考值范围：＜3ng/ml临床应用：监测结直肠癌、胃癌、乳腺癌和支气管癌病程及疗效影响因素：5%吸烟者检测值可至2.5~5ng/ml，1%至10~20ng/ml；肝炎疾病可使CEA水平短暂升高癌胚抗原【CEA】99mTc(鍀）标记抗癌胚抗原单抗C50片段Fab’12医学课件生化特性：糖蛋白，45~60%糖，电泳迁移率，6个生化特性：糖蛋白，4%糖，电泳-1-迁移率分子量：70，000发生部位：卵黄囊、胚胎肝参考值范围：＜15ng/ml临床应用：发现原发性肝细胞癌,监测治疗效果;用于诊断生殖细胞肿瘤影响因素：肝炎疾病可使AFP水平短暂升高;AFP可通过胎盘,妊娠32~36周可达高峰；羊水中AFP浓度与胎儿身长与孕周呈负相关（其95%参考上限5500~200ng/ml，24~41孕周），于正常提示胎儿畸形、死胎、无脑儿和开放性神经缺损等甲胎蛋白【AFP】肝癌细胞AFP+++HCC患者外周血AFPmRNART-PCR（反转录）产物电泳图谱13医学课件生化特性：糖蛋白，4%糖，电泳-1-迁移率甲胎蛋白生化特性：单链糖蛋白，前列腺分泌产物分子量：36，000发生部位：前列腺分泌腺管参考值范围：＜3.7ng/ml临床应用：监测前列腺癌影响因素：具有组织特异性，但不是肿瘤所特异的，注意：应在直肠癌指诊前取血，前列腺癌患者多高于10ng/ml前列腺特异抗原【t-PSA】PCR及重叠延伸产物的琼脂糖凝胶电泳

构建抗前列腺特异抗原(PSA)单链抗体（scFv）/人羧肽酶A（hCPA）融合基因总PSA（t-PSA）中80%以结合形式存在，称复合PSA（c-PSA）；20%以游离形式存在，称游离PSA（f-PSA）；t-PSA及f-PSA升高，而f-PSA/t-PSA比值降低，提示前列腺癌当总PSA在3.0~10.0ng/ml时，f-PSA/t-PSA比值低于0.19~0.10时，前列腺癌的可能性较大14医学课件生化特性：单链糖蛋白，前列腺分泌产物前列腺特异抗原生化特性：糖蛋白，由两个单克隆抗体：1.115D8抗乳脂膜及2.DF3抗乳腺癌细胞系所证实分子量：

115D8：400，000；DF3290，000发生部位：乳腺癌细胞和某些上皮细胞参考值范围：＜28U/ml临床应用：监测乳腺癌疗效影响因素：与CEA联合检测癌抗原15-3【CA15-3】糖与多肽连接的两种方式

？是1984年由Kufer和Hilkens发现，是由鼠抗人乳腺癌肝细胞转移株的膜的单克隆抗体DF3制备的15医学课件生化特性：糖蛋白，由两个单克隆抗体：癌抗原15-3生化特性：糖脂,Lewis()血型决定基半抗原分子量：

抗原:36,000;粘蛋白:106D发生部位：各种肿瘤,在胎儿胃肠道上皮细胞,许多粘膜细胞参考值范围：＜37U/ml临床应用：监测胰腺癌疗效影响因素：结直肠TM的第二选择糖类抗原19-9【CA19-9】是1981年由Koprowski从大肠腺癌细胞系和免疫鼠杂交瘤产物分离而成16医学课件生化特性：糖脂,Lewis()血型决定基半抗原糖类生化特性：糖蛋白,以卵巢癌细胞系免疫所获单克隆抗体所证实分子量：

200,000发生部位：卵巢癌(膜结合物),胎儿和成人支气管正常上皮细胞参考值范围：＜35U/ml(＜65U/ml)临床应用：监测卵巢癌病程及疗效，透明细胞癌，子宫内膜癌、输卵管埃及未分化卵巢癌明显升高影响因素：

来源于体腔上皮细胞衍生物的分化抗原(MÜller’管上皮),特异性低；血清浓度轻微升高正常妇女，以及良性卵巢疾患，怀孕前3个月、行经期、肝硬化、子宫纤维变性、急性输卵管炎、胸膜炎和心包感染等也稍高。

糖类抗原125【CA125】1981年由Bast发现的由鼠抗人乳头状囊性卵巢上皮细胞系OC125制备而成17医学课件生化特性：糖蛋白,以卵巢癌细胞系免疫所获糖类抗原12生化特性：烯醇化酶二聚体分子量：

87,000发生部位：神经系统的神经元和神经内分泌细胞,红细胞,血小板参考值范围：＜12.5ng/ml临床应用：

神经元特异性烯醇化酶是小细胞肺癌(SCLC)和神经母细胞瘤的肿瘤标志物，可用于鉴别诊断、病情监测、疗效评价和复发预报。用神经元特异性烯醇化酶监测小细胞肺癌的复发，比临床确定复发要早4～12周。神经元特异性烯醇化酶还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的鉴别诊断，前者神经元特异性烯醇化酶异常增高而后者增高不明显。增高：见于小细胞肺癌（最敏感最特异的肿瘤标志物之一）、神经母细胞瘤、神经内分泌细胞肿瘤（如嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤、黑色素瘤）等影响因素：

不要将血放置太久，否则将出现假高值；一小时内离心；检测SCLC时，与CEA联合应用神经特异性烯醇化酶【NSE】18医学课件生化特性：烯醇化酶二聚体神经特异性烯醇化酶【NSE生化特性：糖蛋白激素，由两个非共价结合的亚单位组成，a，

分子量：

a：14,000；：24,000发生部位：胎盘合体滋养层,滋养层组织中的胚细胞肿瘤,合体滋养层巨细胞(精原细胞来源许多中空器官的上皮细胞成分)参考值范围：男性:0~5mU/ml临床应用：

非精原细胞瘤胚芽细胞瘤(48~86%),睾丸或胎盘绒毛膜肿瘤(100%),胞虫囊状痣(97%),精原细胞瘤(合并肿瘤)(7~14%)人绒毛膜促性腺激素【HCG】RNA的甲醛变性胶电泳结果，可见清晰的18S、28S两条带及其距加样孔的距离

PCR扩增后进行PAGE电泳及放射自显影结果箭头所示条带T26只在绒癌中显示，在正常绒毛中不显示19医学课件生化特性：糖蛋白激素，由两个非共价结合的亚单人绒毛膜生化特性：增生性抗原,多肽，由B1、B2和C三个亚基组成，其活性主要在B1分子量：

17,000～43,000发生部位：卵黄囊,胚胎肝参考值范围：＜80U/L临床应用：

膀胱癌？正常人阳性率4.7%。但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在，其阳性率约为14%～35%，以下呼吸道、肝及尿路感染者多见，故TPA亦非肿瘤所特有的标志。但在恶性肿瘤者中，TPA的增高往往是持续性的，因此，若进行连续监测，常常有利于恶性肿瘤与非恶性病变的鉴别

影响因素：

测定值＞80:膀胱、支气管、卵巢、胃癌，可能为肝，肾，肺等疾病；特异性低组织多肽抗原【TPA】20医学课件生化特性：增生性抗原,多肽，由B1、B2和C三个亚基组生化特性：多肽（32个氨基酸）分子量：

3,500发生部位：C细胞，胸腺也有分泌降钙素的机能

参考值范围：

＜100pg/ml临床应用：

甲状腺髓样癌：此种癌起源于甲状腺滤泡旁细胞（C细胞），可产生多种生物活性物质，其中以降钙素为主。患者血清降钙素水平高于正常数十到数百倍。如经手术治疗，则降钙素水平恢复正常影响因素：

适用于危险人群筛查和辅助诊断；肺小细胞癌可产生多种激素，其中包括降钙素

降钙素21医学课件生化特性：多肽（32个氨基酸）降钙素21医学课件生化特性：糖蛋白,即由两个单克隆抗体所识别的TAG72:1:CC49,2:B72-3分子量：

400,000发生部位：上皮细胞参考值范围：

＜3U/ml临床应用：

胃癌,卵巢粘液癌影响因素:

与CEA联合检测胃癌,卵巢癌的第二选择标志物癌抗原72-4【CA72-4】1989年由Gero首先测定22医学课件生化特性：糖蛋白,即由两个单克隆抗体所识别的癌抗原生化特性：与IgG分子的重链和轻链的C片段同型,与HLA共同片段的部分相同分子量：

11,800发生部位：淋巴细胞,巨嗜细胞和一些上皮细胞表面参考值范围：1.2~2.5mg/l临床应用：

多发性骨髓瘤,非何杰金氏淋巴瘤（NHL）影响因素：

在肾脏疾病诊断中也有重要意义

-2-微球蛋白【-2-m】23医学课件生化特性：与IgG分子的重链和轻链的C片段同型,与-生化特性：糖蛋白,肿瘤抗原T4分子量：

48,000发生部位：主要存在于子宫颈鳞状细胞癌,正常鳞状上皮参考值范围：＜2.5ng/ml临床应用：监测宫颈、耳、鼻、喉、肺和食管鳞状细胞癌病程及治疗影响因素：被皮肤或唾液污染后可导致假性高值鳞状上皮细胞癌抗原【SCC】24医学课件生化特性：糖蛋白,肿瘤抗原T4鳞状上皮细胞癌抗原生化特性：细胞角蛋白片段19分子量：

30,000发生部位：存在于许多组织中，特别是肺中参考值范围：

＜3.3ng/ml临床应用：

非小细胞肺癌影响因素：

被唾液污染后可导致假性高值细胞角蛋白组分19【CYFRA21-1】细胞角蛋白阳性细胞肺癌脑转移25医学课件生化特性：细胞角蛋白片段19细胞角蛋白组分19【糖类抗原50【CA50】生化特性：糖类抗原CA50是一种以唾液酸酯和唾液酸糖蛋白为主的肿瘤标志物参考范围：＜23U/ml临床意义：糖类抗原CA50是一种非特异性的广谱肿瘤标志物，与癌抗原19-9有一定的交叉抗原性，主要用于胰腺癌、结肠／直肠癌、胃癌的辅助诊断，其中胰腺癌病人增高最明显。增高：见于胰腺癌（阳性率可达87％）、结肠／直肠癌、胃癌、肺癌。肝癌。卵巢癌、乳腺癌等恶性肿瘤；溃疡性结肠炎、肝硬化、黑色素瘤、淋巴瘤、自身免疫性疾病等也增高26医学课件糖类抗原50【CA50】26医学课件糖类抗原242【CA242】CA242是一种唾液酸化的新型粘蛋白类糖类肿瘤抗原1993年Pujol等采用迟缓铕镧荧光分析技术测定102例NSCLC患者血清CA242浓度，CA242血清浓度阈值为20.0U/ml，结果其敏感性及特异性分别为28.5%和95.6%。肺鳞癌患者血清CA242水平显著低于非鳞癌(腺癌和大细胞肺癌)患者，发生远处转移者的CA242浓度高于未转移者，且Ⅰ～Ⅳ期浓度逐渐增加。从整体角度看，CA242水平与生存不相关，但是，在不能手术切除的NSCLC患者中，CA242浓度升高患者的生存期较浓度低于20U/ml患者显著短。由于CA242敏感性较低，对NSCLC的诊断无意义CA242可作为胰腺癌和结肠癌校好的肿瘤标志物，其灵敏度与CA19-9相仿，但特异性、诊断效率则优于CA19-9参考值：＜25U/ml27医学课件糖类抗原242【CA242】CA242是一种唾液酸化的新

CA549也是乳腺癌的标志物，它是一种酸性糖蛋白

大部分健康女性＜11U／mL

异常升高者比例并不高，可见于50%乳腺癌、卵巢癌、40%前列腺癌、33%肺癌患者。由此，作为乳腺癌的早期诊断，CA则还较欠缺，应联合应用其它TM

糖类抗原594【CA549】28医学课件CA549也是乳腺癌的标志物，它是一种酸性糖类抗原594【血清碱性磷酸酶【ALP或AKP

】是一组底物特异性较低，在碱性环境中能水解很多磷酸单酯化合物的酶AFP在器官组织的含量：肝肾胎盘小肠骨＞＞＞＞磷酸对硝基酚（底物）2-氨基-2-甲基-1-丙酮（受体）+ALP对硝基酚+碱性溶液405nm变黄色，连续监测法参考值：女性：1~12岁＜500U/L；＞15岁，40~150U/L男性：1~12岁＜500U/L；12~15岁，＜750U/L＞15岁，40~150U/LAFP活力测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。升高：骨Paget病、胆道梗阻、恶性肿瘤骨转移或肝转移、佝偻病、骨软化、成骨细胞瘤、甲状旁腺功能亢进及骨折愈合期降低：少见，呆小症、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症。甲功低下、恶性贫血临床意义29医学课件血清碱性磷酸酶【ALP或AKP】是一组底物特异性较低，在阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死，碱性磷酸酶明显升高（肝细胞性黄疸则升高不明显）原发性和继发性肝癌时碱性磷酸酶亦明显升高，与癌组织中或癌肿周围肝细胞合成碱性磷酸酶增加有关

其他肿瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨细胞瘤、骨肉瘤等，碱性磷酸酶增高时，提示可能有肝脏转移

变形性骨炎、成骨细胞癌、佝偻病、骨软化、甲状腺及甲状旁腺功能亢进、肾小管性酸中毒、遗传性磷酸酶过多症

很多药物可使碱性磷酸酶增高，如巴比妥类、抗生素（红霉素、庆大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等

常见于重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质、儿童甲状腺功能不全或减退、维生素C缺乏症坏血病）。营养不良、呆小症、遗传性低磷酸酶血症。增高减低血清碱性磷酸酶【ALP或AKP

】30医学课件阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死，碱性磷酸酶明显升高（肝细胞性黄疸酸性磷酸酶测定【ACP】磷酸麝香草酚酞（YMP）ACP麝香草酚酞+无机磷碱液终止反应麝香草酚酞

呈蓝色595nmα-磷酸萘胺

ACP酸性条件α-萘胺+磷酸固红TR盐重氮化合物总酸性磷酸酶活性－非前列腺酸性磷酸酶活性=前列腺酸性磷酸酶活性酒石酸抑制405nm参考值：成人总酶活性为0~9U/L，前列腺酸性磷酸酶活性为0~3U/LACP含量无性别差异，新生儿出生后1个月血清酶活性甚高，随年龄增长而逐渐下降；青春期又可出现一活性峰值，至20岁降至成人水平ACP主要用于前列腺癌的辅助诊断及疗效观察指标，特别是转移时，血清ACP可明显增高溶血性疾病、变形性骨炎、急性尿潴留及近期做过直肠检查者，此酶也可增高临床意义31医学课件酸性磷酸酶测定【ACP】磷酸麝香草酚酞（YMP）ACP麝香草P53蛋白是一种由393个氨基酸组成的含磷蛋白，位于细胞核。研究发现在癌旁正常和鳞状化生的支气管上皮未见P53蛋白表达，在轻→中→重度不典型增生、原位癌、浸润癌中，P53蛋白表达的阳性率逐渐升高，表明P53基因与肺癌发生有关对P53基因的不同类型肿瘤中突变频率检测结果，鳞癌为63.6%，腺癌为65%，发现P53蛋白在不同分化程度肺癌组织之间无显著性差异，但在肺鳞癌组织中随分化程度降低P53表达却增强，认为P53蛋白与肺鳞癌的关系可能较肺腺癌更为密切。而且在肺鳞癌伴有和不伴有淋巴结转移病例中，P53表达无显著性差异，而肺腺癌中伴有与不伴有淋巴结转移者P53表达具有显著性差异，提示P53过度表达与肺腺癌淋巴结转移有关P53蛋白鳞癌P53细胞核阳性32医学课件P53蛋白是一种由393个氨基酸组成的含磷蛋白，位于细胞核。bcl-2蛋白是原癌基因bcl-2编码的一种能调节细胞死亡而不影响细胞增殖的蛋白质，1993年Pezzella等研究bcl-2在NSCLC患者中的表达与预后之间的关系。该实验采用bcl-2特异性单克隆抗体及免疫组化染色测定80例肺鳞癌及42例肺腺癌患者肿瘤组织中bcl-2蛋白。结果25%(20/80)的鳞癌患者及12%(5/42)的腺癌患者bcl-2蛋白阳性，在邻近的正常呼吸道上皮中，bcl-2蛋白仅存在于基底细胞。bcl-2蛋白阳性患者的5年生存率高于阴性患者(P<0.1)，年龄为60岁或60岁以上bcl-2蛋白阳性患者的预后最好(P<0.02)。该研究表明，原癌基因bcl-2在肺癌患者中发生异常表达，其表达与预后有一定关系原癌基因bcl-2蛋白33医学课件bcl-2蛋白是原癌基因bcl-2编码的一种能调节细胞死亡而肿瘤标志物的组合应用-Ⅰ标志CEAARPCA19-9CA72-4CA125CA15-3SCCHCG肿瘤结肠

●

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胰腺●

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胃●

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食道●

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肝脏●

胆囊●

乳腺●

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卵巢●

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子宫颈●

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绒毛膜●

34医学课件肿瘤标志物的组合应用-Ⅰ标志CEAARPCA19肿瘤标志物的组合应用-Ⅱ标志CEAARPNSESCCCYFRA21-1HCGPSATPACalcitoninHTG

肿瘤肺（SCLC）●●肺（NSCLS）●●胚胎细胞●●前列腺●膀胱●

●甲状腺●●C-细胞●●耳鼻咽喉●●35医学课件肿瘤标志物的组合应用-Ⅱ标志CEAARPN临床检测肿瘤标志物试验方法进展◆单相琼脂扩散法◆双相琼脂扩散法◆血凝法◆对流电泳法◆火箭电泳法◆放射免疫法（RIA）◆免疫放射法（IRMA）◆

ELISA法◆斑点法◆金标法◆荧光免疫法◆化学发光法（CLIA）◆电化学发光法（ECLIA）◆分子生物学36医学课件临床检测肿瘤标志物试验方法进展◆单相琼脂扩散法◆ELISA双相琼脂扩散法单相琼脂扩散法抗体与凝胶混合后，装于小玻璃管中，待凝固后加入抗原溶液，使其扩散入凝胶与抗体反应形成环状乳白色沉淀带

一种抗原或抗体混合物成分的定性与定量的分析方法。通常采用凝胶作为支持介质，让抗原与抗体混合物在介质中互相扩散，相互反应形成沉淀弧线或沉淀弧带37医学课件双相琼脂扩散法单相琼脂扩散法抗体与凝胶混合后，装于小玻璃管中血凝法细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）根据凝集反应的原理，以后又发展建立了，各种间接凝集试验、间接凝集抑制试验以及固相免疫吸附血凝试验等新方法

38医学课件血凝法细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适

胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的-种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原(加药物、团体激素等)进行精确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳微粒(一般为直径约1μm的聚苯乙烯胶乳)，与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此可测出标本中待测物的含量。测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种39医学课件胶乳微粒免疫检测技术39医学课件

对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动(电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗)在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。此法操作简便，仅需30～60分钟，灵敏度比双向扩散高10～15倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高40医学课件对流免疫电泳40医学课件

火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis，RIEP)是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)

41医学课件火箭免疫电泳41医学课件竞争法双抗体夹心法间接法

酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验)。最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称ELISA(enzymelinkedimmunosorbantassay)

42医学课件竞争法双抗体夹心法间接法

免疫印迹技术免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Westernblotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)或非变性电泳(Native)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测43医学课件免疫印迹技术43医学课件

免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等致敏方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景

44医学课件免疫微粒技术44医学课免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的

45医学课件免疫荧光细胞化学技术45医学课件

免疫组织化学技术又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。全过程包括：

抗原的提取与纯化；

免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；

将显色剂与抗体结合形成标记抗体；

标本的制备；

免疫细胞化学反应以及呈色反应；

观察结果

46医学课件免疫组织化学技术46医学课件

免疫电镜技术(Immuneelectronmicroscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。首创此项技术的是Singer(1959)，他最先使用铁蛋白标记抗体的方法47医学课件免疫电镜技术47医学课件

流式细胞仪(Flowcytometer，FCM)能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。通常是应用一个激光和有关的光学检测系统来收集这些信号以供分析。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他方法无法比拟的。它可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到脑浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。它在免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学等学科中已形成了独立的学科分支使用程序48医学课件流式细胞仪使用程序48医学课件

免疫磁性微粒分离与纯化技术

磁性微粒(magneticmicrospheres,MMS)是80年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将MMS应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成免疫MMS，与检样中的抗原结合形成免疫MMS-靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞49医学课件免疫磁性微粒分离与纯化技术49医学课件放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏度、精确度和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量小是其优点；但核素的放射性，对工作人员和环境易造成危害和污染，是其缺点

放射免疫分析【RIA】是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量的特异性抗体竞争性结合反应Ag*Ag＋Ab

Ag*Ab＋Ag*

Ag＋Ab第二Ab法聚乙二醇沉淀法PR法活性炭吸附法分离

免疫放射分析【IRMA】是非竞争性免疫结合反应，用过量的放射性核素标记抗体（Ab*）与待测抗原反应，待充分反应后，除去游离的Ab*，AgAb*＋Ab*结合物的放射性强度与待测抗原呈正比关系Ag＋Ab*=AgAb*＋Ab*Ag双点位IRMA单点位IRMAAg固相抗原Ag50医学课件放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏度、放射免疫分析【RIA】模式放射免疫分析广义还包括放射受体分析及放射配体结合分析放射免疫分析常用的放射性核素有125I、130I、3H、14C等51医学课件放射免疫分析【RIA】模式放射免疫分析广义还包括放射受体分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物进样系统反应池PMT放大器记录仪负高压

检测系统化学发光分析法仪器方框图PMT:光电倍增管

52医学课件化学发光免疫分析化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系

电化学发光技术用先进的电化学发光技术(ECL),是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上包括了电化学和化学发光两个过程,由电启动发光反应,因此可对反应进行精确控制,其采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物,结合了标记物的生物分子与配体发生特异的结合反应后进入流动测量室,此时,电发光过程被启动。基本过程如下:含三丙胺(TPA)的缓冲液进入测量室,同时电极加电,化学发光剂…

53医学课件电化学发光技术基因芯片技术基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量54医学课件基因芯片技术基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，

蛋白芯片技术蛋白芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面行成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测55医学课件蛋白芯片技术55医学课件6050403020100肿瘤患者%7.07.04.27.07.4临界值(ng/ml)5033282722在实体肿瘤患者中,CEA特异性为95%时的敏感性参考值范围：＜3ng/ml在实体肿瘤患者中CEA表达状况56医学课件60肿瘤患者7.07.010080604020(%)959127142293900＜1515~100100~10001000~10,00010,000~100,000原发性肝细胞癌肝转移癌AFP(ng/ml)

原发性肝细胞癌和其他恶性肿瘤肝转移癌中AFP表达状况参考值范围：＜15ng/ml巨型快多结节型介入57医学课件100(%)959127142293900＜15原发性肝细胞癌和肝转移癌AFP和CEA的表达100908070605040302010095992507213(%)AFP＞15ng/mlCEA＞3ng/mlCEA＞10ng/ml原发性肝细胞癌肝转移癌参考值范围：＜3ng/ml参考值范围：＜15ng/ml58医学课件原发性肝细胞癌和肝转移癌AFP和CEA的表达10095992肺癌中肿瘤标志物的应用CYFRA21-1CEANSE治疗前治疗后复查组织类型不明确腺癌鳞状细胞癌小细胞肺癌大细胞肺癌59医学课件肺癌中肿瘤标志物的应用CYFRA21-1CEANSE治疗前治胃癌单项或联合测定CEA、CA19-9及CA72-4的敏感性806040200敏感性（%