薄荷润唇膏微生物指示菌竞争性试验

薄荷润唇膏微生物指示菌竞争性试验

主要成分为：矿油、土壤蜡、矿脂、肉桂、肉桂枝、乙酰胺、水杨酸、羊毛脂、薄荷醇、樟脑、绿桉叶油、欧洲红松叶油和水杨酸。由于含有大量油、酯类物质，按化妆品微生物检验1试验材料1.1xk137-717曼秀蕾敦(中国)药业有限公司，生产许可证号:XK16-1081377，卫妆准字29-XK-0649，国妆特字G20100002，有效期:2020年10月。1.2培养基和培养基卵磷脂吐温80营养琼脂，批号:190221;SCDLP液体培养基，批号:180202;孟加拉红琼脂，批号:180119;双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，批号:180609;Baird-Parker培养基，批号:190122;甘露醇发酵培养基，批号:180811;伊红美蓝琼脂(EMB)，批号:190827;十六烷三甲基溴化铵琼脂，批号:190813;pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液，批号:20200312。均购于北京陆桥技术股份有限公司。1.3菌株atcc大肠埃希菌[ATCC8739]、铜绿假单胞菌[ATCC27853]、枯草芽孢杆菌[ATCC6633]、金黄色葡萄球菌[ATCC6538]、白色念珠菌[ATCC10231]和黑曲霉[ATCC16404]。购于中国食品药品检验研究院。1.4仪器、设备、仪器超净工作台(厂家:苏州苏净、型号:SW-CJ-2D型)、生物安全柜(厂家:ESCD、型号:CLASS11BSC)、生化培养箱(厂家:上海一恒、型号:BPMJ-250F)、压力消毒器(厂家:松下、型号:MSL-3781L-PC)、恒温水浴锅(厂家:杭州米欧仪器有限公司、型号:WT100-2)、电冰箱(厂家:江苏白雪、型号:6C13080177)、显微镜(厂家:奥林巴斯、型号:BX53+DP74)、电热恒温干燥箱(厂家:北京科伟永兴仪器有限公司、型号:101-3AB)、天平(厂家:诸暨超泽、型号:JMA5001)。2方法和结果2.1病毒试验所用菌种为第3代，菌悬液为第4代。2.2供试液的制备取薄荷润唇膏5g加到灭菌的三角瓶中，加入5mL灭菌吐温-80，加入pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100mL，置于45℃水浴中，溶解，用匀浆仪混匀3min，制成1∶20g/mL供试液。2.3计数方法试验1)试验组取1∶20g/mL供试液，分别加入5种试验菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌悬液，制成含菌数小于100cfu的供试液，取含菌的样品溶液1mL，每个菌液注2个平皿，注入所需培养基，培养、计数。2)菌液对照组分别取5种实验菌的菌悬液(50～100cfu)1mL注皿，加培养基、培养、计数。3)供试品对照组用供试品替代实验组液体注皿，实验。4)阴性对照组用同批配制、灭菌的SCDLP1mL替代样品注皿，注入培养基、培养、计数。计数方法试验(1)的结果见表1。结果，采用1∶20g/mL的供试液1mL注皿，金黄色葡萄球菌的回收率小于50%，方法不可行。2.4计数方法试验结果将供试液1∶20g/mL稀释成1∶50g/mL和1∶100g/mL，加入金黄色葡萄球菌的菌悬液，进行挑战性试验。计数方法试验(2)的结果见表2。结果，细菌总数采用1∶50g/mL的供试液1mL注皿，霉菌和酵母菌总数采用1∶20g/mL的供试液1mL注皿，回收率试验满足指示菌挑战性试验要求，检验方法可行。2.5测定总scdlp液体培养基培养液菌数1)试验组。取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入100mLSCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，加入铜绿假单胞菌菌悬液1mL(小于100cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。2)阳性对照。将铜绿假单胞菌菌悬液1mL(小于100cfu)加到100mLSCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验;同时测定铜绿假单胞菌菌悬液菌数。3)供试品对照组。取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入100mLSCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。4)阴性对照。同批配制、灭菌，100mLSCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。铜绿假单胞菌方法适用性试验结果，见表3结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版铜绿假单胞菌常规方法进行试验，可以检出试验菌-铜绿假单胞菌，方法可行。2.6金属丝检验方法的创新试验2.6.1细菌适用性试验1)试验组。取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入100mLSCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，加入金黄色葡萄球菌菌悬液1mL(小于100cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版金黄色葡萄球菌检查项进行试验。2)阳性对照将金黄色葡萄球菌菌悬液1mL(小于100cfu)加到100mLSCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验;同时测定金黄色葡萄球菌菌悬液菌数。3)供试品对照组取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入100mLSCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。4)阴性对照同批配制、灭菌100mLSCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。金黄色葡萄球菌方法适用性试验(常规法)结果，见表4。结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版金黄色葡萄球菌的常规方法进行试验，未检出试验菌-金黄色葡萄球菌，方法不可行。2.6.2细菌生长实验结果试验组、阳性对照、供试品对照组和阴性对照组SCDLP液体培养基的体积采用300mL进行金黄色葡萄球菌的生长实验，结果见表5。结果表明，参照《化妆品安全技术规范》2015年版和《中国药典》2015年版1106金黄色葡萄球菌检验方法，增加培养基体积，进行挑战性实验，检出试验菌-金黄色葡萄球菌，方法可行。2.7耐热大肠菌群检验1)试验组。取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入20mL双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)到灭菌的试管中，加入大肠埃希菌菌悬液1mL(小于100cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版耐热大肠菌群检查项进行试验。2)阳性对照。将大肠埃希菌菌悬液1mL(小于100cfu)加到20mL双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验;同时测定大肠埃希菌菌悬液菌数。3)供试品对照组。取薄荷润唇膏1∶20g/mL的供试液20mL加入20mL双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)到灭菌的试管中，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。4)阴性对照。同批配制、灭菌20mL双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。耐热大肠菌群方法适用性试验结果，见表6。结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版耐热大肠菌群的常规方法进行试验，可以检出试验菌-大肠埃希菌，方法可行。3挑战试验结果1)薄荷润唇膏由于含有大量脂溶性基质，不易制备成均