SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书

JETWAYCat.No：LotNo：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极邙日极）迁移。由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离一凝胶的分子筛效应。蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原;9）分离放射性标记的蛋白质。试剂盒组成：1.30%预制聚丙烯酰胺胶（4°C保存）200mlTOC\o"1-5"\h\z1.5MTrisCl(PH=8.8)200ml1.0MTrisCl(PH=6.8)50ml10%SDS30ml10%过硫酸铵(4C保存)30ml去离子水250mlTEMED(4C闭光保存！)1ml5XTris-甘氨酸电泳缓冲液250ml考马斯亮蓝染色剂50ml考马斯亮蓝脱色剂250ml5XTris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1:4稀释，配成1X-甘氨酸电泳缓冲液工作液。凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏2)进行分离胶的配制(3)加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)再在胶液面上小心注入一层水(约2—3mm高)以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。4)待凝胶聚合完全后(约15分钟)倾出覆盖水层，再用滤纸吸经残留水。(5)在另一小烧杯中配制一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，加入TEMED后应立即快速旋动混合物倒入到玻璃板中。胶倒入之后将干净的梳子插入到积层胶内，注意不要有气泡混入，将凝胶置于室温。待积层胶聚合后即可进行上样。用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色脱色：当凝胶电泳结束后，将凝胶拆下放入一容器内，加入考马斯亮蓝染色剂对SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品进行染色，染色时间约30分钟—60分钟，染色结束后更换考马斯亮蓝脱色剂，需20—60分钟，期间许更换2次脱色液直至背景清楚。脱色完毕后可浸泡在水中，如长期保存可对凝胶进行拍照或将凝胶干燥成胶片。注意事项：本试剂盒中部分试剂应置于4°C保存，30%预制聚丙烯酰胺胶缓冲液对人体有神经毒性，故操作时应谨慎小心，如溅到皮肤或眼睛等应立即用清水冲洗。表A-1配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液成分配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/ml5101520253040506%胶水10.613.215.921.226.530%丙烯酰胺混合液(!)1.02.03.04.05.06.08.010.01.5mol/LTris(pH8.8)5.06.37.510.012.510%SDS0.00.510%过硫酸铵(!)0.00.5TEMED(!)0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%胶水9.311.513.918.523.230%丙烯酰胺混合液(!)10.713.31.5mol/LTris(pH8.8)5.06.37.510.012.510%SDS0.00.510%过硫酸铵(!)0.00.5TEMED(!)0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%胶水1.94.011.915.919.830%丙烯酰胺混合液(!)6.78.310.013.316.7

1.5mol/LTris(pH8.8)5.06.37.510.012.510%SDS0.00.510%过硫酸铵(!)0.00.5TEMED(!)0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0212%胶水13.216.530%丙烯酰胺混合液(!)2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mol/LTris(pH8.8)5.06.37.510.012.510%SDS0.00.510%过硫酸铵(!)0.00.5TEMED(!)0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0215%胶水9.211.530%丙烯酰胺混合液(!)2.55.07.510.012.515.020.025.01.5mol/LTris(pH8.8)5.06.37.510.012.510%SDS0.00.510%过硫酸铵(!)0.00.5TEMED(!)0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02表A-2配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液成分配制不同体积凝胶所需各成分的体积/ml123456810水30%丙烯酰胺混合液水30%丙烯酰胺混合液(!)1.0mol/LTris(pH6.8)10%SDS10%过硫酸铵(!)TEMED(!)0.60.170.330.50.680.50.010.020.030.040.010.020.030.040.0010.0020.0030.006.80.831.030.751.01.250.050.060.080.10.050.060.080.