加味济生肾气汤对糖尿病肾病大鼠足细胞和自噬作用的影响

加味济生肾气汤对糖尿病肾病大鼠足细胞和自噬作用的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是临床上常见的糖尿病微血管并发症之一。这是糖尿病患者和终末期肾病患者去世的主要原因之一。肾为先天之本，如若肾水亏损日久则气阴两虚、精气亏耗。济生肾气汤以温肾阳、行气利水的作用缓解疾病，其中，附子、山茱萸及肉桂可养阴中之真气，丹皮、地黄及山药可养阴中之真水，泽泻、牛膝、茯苓及车前子可化气于精1材料和方法1.1实验试剂：nh-pca动物：66只日龄90天，体质量为226.7±17.5g的SPF级雌性SD大鼠购于湖北省疾病预防控制中心，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。动物合格证号NO.42000600026493。加味济生肾气汤主要试剂：STZ（阿拉丁控股集团有限公司，中国，货号：S110910），羟苯磺酸钙（上海朝晖药业有限公司，中国，国药准字：H20030089），戊二醛（国药集团化学试剂有限公司，中国，货号：30092436），锇酸（TedPella,Inc.，美国，货号：18456），兔抗Nephrin抗体（Abcam，英国，货号：Ab58968，稀释比例1∶500）、兔抗微管相关蛋白1轻链3(microtubule-as-sociatedprotein1lighechain3,LC3)I/II抗体（Abcam，英国，货号：Ab51520，稀释比例1∶3000）、兔抗P62抗体（Abcam，英国，货号：Ab91526，稀释比例1∶1000），免疫组化二抗（福州迈新生物技术开发有限公司，中国，货号：KIT5020),DAB（北京索莱宝科技有限公司，中国，货号：DA1010-2）。主要仪器：白光显微镜（Leica，德国，型号：DM1000),JEM-1010透射电镜（HitachiLimited，日本，型号：HT7700），全自动化学发光分析仪（上海天能科技有限公司，中国，型号：Tanon-5200）。1.2方法1.2.1模型构建及相关处理随机挑取55只大鼠采用随机数字表法分为模型组，羟苯磺酸钙组，加味济生肾气汤低、中、高剂量组，每组11只。剩下11只作为对照组。饲养环境控制在23°C左右，自然光源，自由饮水。饲养7天后，对模型组，羟苯磺酸钙组，加味济生肾气汤低剂量组，加味济生肾气汤中剂量组，加味济生肾气汤高剂量组进行模型构建和相应处理。造模方法：大鼠喂养高糖高脂饲料（含20%猪油，20%白糖，6%蛋黄粉，54%基础饲料）5周后，禁食12h，每天腹腔注射一次25mg·kg1.2.2透射电镜观察足细胞大鼠肾组织经4%戊二醛固定，2%锇酸后固定，再以Epon812进行包埋，用JEM-1010透射电镜观察肾小球足细胞、基底膜的超微结构。1.2.3肾组织蛋白及免疫将大鼠肾脏组织经过脱水，包埋于蜡块中，以5µm的厚度均匀切片。取细胞玻片用4%多聚甲醛固定。组织玻片脱蜡后用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，玻片置于500mL的柠檬酸钠缓冲液中（0.01mol·L提取肾组织蛋白并定量，取25µg处理好的蛋白，60V预电泳30min,100V电泳1h，在转膜缓冲液中100V转膜30min,TBS封闭液封闭1h，兔抗大鼠LC3I/II,P62抗体在4°C下过夜，分别加二抗，室温孵育二抗1h,TBST洗涤10min，重复3次，曝光显影，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测；采用BIO-RADImageLab3.0软件进行灰度值分析。1.3统计学分析方法采用SPSS22统计软件对数据进行统计分析，计量数据均采用平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey’s方法进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠足细胞不同组织形态变化电镜下观察足细胞形态，结果如图1所示，对照组足细胞形态正常。与对照组相比，模型组大鼠肾小球基底膜可见显著增厚，足细胞排列较紊乱，数目减少，足突融合。与模型组比较，羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤中、高剂量组细胞外基质减少，系膜区增宽程度减轻，足细胞数目增多，足突融合较少，基底膜的厚度减小。2.2各组大鼠肾组织中的niphren水平比较免疫组化检测Nephrin的表达，结果如图2所示。与对照组比较，模型组大鼠肾组织中的Nephrin水平显著降低（P<0.05）。与模型组比较，加味济生肾气汤高剂量组大鼠肾组织中的Nephrin水平明显升高（P<0.05）。2.3鼠肾组织中lc3iii/i比值LC3II/I和P62的检测结果如图3所示。与对照组比较，模型组大鼠肾组织中的LC3II/I比值显著降低，P62水平显著升高（P<0.05）。与模型组比较，羟苯磺酸钙组及加味济生肾气汤组大鼠肾组织中的LC3II/I比值均显著升高，P62水平均显著降低（P<0.05）。3并发症及其防治近年来，人们的生活质量不断提高，但随之，也逐渐带来了许多疾病发病率增加，如糖尿病，其中DN为糖尿病中常见并发症之一，其发病机制复杂多样，涉及糖代谢异常、氧化应激、炎症反应及自噬等多个方面DN患者肾脏足细胞早期损