实验一细菌基因组DNA的提取课件

细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化细胞破碎机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取SDS（十二烷基硫酸钠）法：SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质）蛋白质：常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA：常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质：提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖：提取液中加1％PVP。

核酸提取的一般过程细胞破碎核酸提取的一般过程核酸样品的保存温度：

4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：

TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0核酸样品的保存二、材料、设备及试剂

菌种：大肠杆菌DH5α设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器，水浴锅（37℃、60℃）试剂：LB液体培养基、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂盒。二、材料、设备及试剂菌种：大肠杆菌DH5α1、细菌37℃过夜培养，取1ml培养物12000rpm室温离心1min。2、沉淀物加入180ulTE缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul50mg/ml溶菌酶，混匀后于30℃温育10min。3、12000rpm离心5min,弃上清后加入200ulBufferBTL，漩涡震荡悬浮细胞。4、加入25ul蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于55℃温育30min，每隔10min漩涡震荡一次。5、加入220ulBufferBDL，颠倒混匀，于65℃温育10min。6、加入220ul无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。7、转移样品至DNA纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管,12000rpm离心1min使DNA结合在纯化柱上，弃去收集管。8、将DNA纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入500ulBufferHB，12000rpm离心1min，弃去滤液。9、DNA纯化柱中加入700ulDNAWashBuffer，12000rpm离心1min，弃去滤液。10、重复步骤9一次。12000rpm离心2min，干燥DNA纯化柱。11、将DNA纯化柱转移至1.5mlEP管中，加入50ul预热（65℃）的ElutionBuffer,室温放置3min，12000rpm离心1min。三、操作步骤1、细菌37℃过夜培养，取1ml培养物12000rpm四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：