质谱分析仪-课件

第十九章质谱分析仪第十九章质谱分析仪1第一节质谱分析的基本原理质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中的运动规律，然后按照质量或质荷比（m/z）实现分离分析，测定离子质量及其强度分布。这种按质量或质荷比大小顺序排列而成的图谱就是质谱图。第一节质谱分析的基本原理质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中2质谱分析法主要是通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法电离装置把样品电离为离子质量分析装置把不同质荷比的离子分开经检测器检测之后可以得到样品的质谱图1、基本定义3质谱分析法主要是通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定质谱法是唯一可以确定分子质量的方法；灵敏度高；样品用量少，通常只需微克级样品，检出限可达10-14g；质谱仪种类很多，应用范围广，可进行同位素分析，也可进行化学分析，可进行无机成分、有机结构分析，生物样品分析；被分析对象：气体、液体、固体。2、质谱分析的特点质谱法是唯一可以确定分子质量的方法；2、质谱分析的特点43、质谱分析的基本原理产生离子的方法：电子轰击(EI)、化学电离(CI)、快原子轰击(FAB)、电喷雾电离(ESI)等。电子轰击离子化法是有机化合物电离的常规方法。化学电离法可得到丰度较高的分子离子或准分子离子峰。3、质谱分析的基本原理产生离子的方法：电子轰击(EI)、化学54、质谱图横坐标：m/e(质荷比);纵坐标：相对强度

最强的峰为基峰，规定其强度为100%.峰的强度与该离子出现的几率有关。丰度最高的阳离子是最稳定的阳离子。4、质谱图横坐标：m/e(质荷比);纵坐标：相对强度6大多数阳离子带电荷+1，故其峰的m/e值为阳离子的质量;m/e值最大的是母体分子的分子量.(除母体离子发生裂解等)。

大多数阳离子带电荷+1，故其峰的m/e值为阳离子的质量;71、分子离子峰试样分子在高能电子撞击下失去一个外层电子而形成的带正电荷的离子，即；M+为分子离子或母体离子。分子离子的质量与化合物的分子量相等。5、质谱图中离子主要类型1、分子离子峰M+为分子离子或母体离子。分子离子的质量与8一般有机分子的电离电位在7-15eV，几乎所有的有机分子都有可以辨认的分子离子峰。芳香环分子可产生较强的分子离子峰；高分子量的脂肪醇、醚及胺等产生较小的分子离子峰；若不考虑同位素的影响，分子离子峰一般具有最高质量。分子离子峰的稳定性越大，那么质谱图上对应的分子离子峰越高。有机化合物分子离子峰的稳定性顺序：芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇一般有机分子的电离电位在7-15eV，几乎所有的有机分子都有9分子离子峰：质谱图上质荷比最大的峰分子离子峰：质谱图上质荷比最大的峰10[氮规则]当分子中含有偶数个氮原子或不含氮原子时,分子量应为偶数；当分子中含有奇数个氮原子时,分子量应为奇数。[氮规则]112、碎片离子峰分子离子产生后可能具有较高的能量，将会通过进一步碎裂或重排而释放能量，碎裂后产生的离子形成的峰称为碎片离子峰。碎片离子峰的峰高与化学键断裂及分子结构有关，碎片离子峰越稳定它的峰高也越高。烯烃多在双键旁的第一个键上开裂：

烷烃化合物断裂多在C-C之间发生，且易发生在支链上：2、碎片离子峰烯烃多在双键旁的第一个键上开裂：

烷烃化合物断12如：正己烷如：正己烷133、亚稳离子峰若质量为m1的离子在离开离子源受电场加速后，在进入质量分析器之前，由于碰撞等原因很容易进一步分裂失去中性碎片而形成的m1+m2+△m这种亚稳离子峰的表观质量用m*表示，它与m1、m2的关系为：m*=（m2）2/m1

式中m1为母离子的质量，m2为子离子的质量。亚稳离子峰具有离子峰宽（约2-5个质量单位）、相对强度低、m/z不为整数等特点，因而很容易从质谱图中观察。3、亚稳离子峰14例如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2分子离子峰同位素离子峰

因为，在甲烷中，I17/I16=0.011。所以，在丁烷中，出现一个13C的几率是甲烷的4倍，则分子离子峰m/z=59、58的强度之比I59/I58=4×0.011=0.044；4、同位素离子峰有些元素具有天然存在的稳定同位素，会在质谱图上出现一些M+1，M+2，M+3的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。同位素离子峰相对峰高取决于分子中同位素的种类、数量和丰度。例如：CH4M=16分子离子峰同位素离子峰15CHCHCHCZHR1R2R3R4CHCHR3R4HCCZHR1R2

5、重排离子峰在两个或两个以上键的断裂过程中，某些原子或基团从一个位置转移到另一个位置发生重排，并丢失掉中性分子或碎片后而形成的离子，称为重排离子。质谱图上相应的峰为重排离子峰。其中最常见的一种是麦氏重排。这种重排形式可以归纳如下：

可以发生这类重排的化合物有:酮、醛、酸、酯、含P=O，＞S=O的化合物、烯烃类和苯类化合物等。16CHCHCHCZHR1R2R3R4CHCHR3R4HCCZH1.质量测量范围它是指质谱仪能够进行分析的样品的相对原子质量范围，以原子质量单位来进行计量。一个原子质量单位（1u）就是处于基态12C中性原子的质量的1/12。

在非精确测量中，常直接以原子或分子量大小来表示。质量单位：amu或u，Da或D，1D=0.99734u第二节质谱仪性能指标1.质量测量范围第二节质谱仪性能指标17不同仪器： 四极杆：4000Da 离子阱质谱：4000Da 磁质谱：10000Da 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-MS） 50000Da 飞行时间质谱：无上限不同要求： 气相色谱：800Da 液相质谱：2000Da 生物分子：10000Da或更大不同仪器： 四极杆：4000Da182.分辨本领指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。定义为：两个相等强度的相邻峰(质量分别为m1和m2)，当两峰间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两已分开，那么分辨率R=m1/(m2-m1)=m1/mR与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因素有关。2.分辨本领19质量数为28的三种分子组成的精确质量若仪器分辨力很低，如RP=200，则对以上三个分子不能分开，混为一峰若要分开以下混合物，则必需有如下分辨力CO-C2H4:(RP)2=27.994914/(28.031299-27.994914)=770N2-C2H4:(RP)3=28.006158/(28.031299-28.006158)=1100CO-N2:(RP)1=27.994914/(28.006158-27.994914)=2490当仪器分辨力达到770时，只能够只分开CO-C2H4

。当仪器分辨力达到1100时，能够分开CO-C2H4和N2-C2H4当仪器分辨力超过2500时，三者全部分开。一般低分辨仪器在2000左右。10000以上时称高分辨。FT-MS分辨力可达2百万。质量数为28的三种分子组成的精确质量若仪器分辨力很低，如RP203、扫描时间色谱峰的数据点数目和峰宽以及扫描时间有关较短的扫描时间，可以获得良好的峰型，但是不利于信号采集较长的扫描时间，有助于信号采集，但是峰型不好峰型和信号，二者需折衷考虑3、扫描时间色谱峰的数据点数目和峰宽以及扫描时间有关214灵敏度质谱仪的灵敏度有绝对灵敏度、相对灵敏度和分析灵敏度。绝对灵敏度：仪器可以检测到的最小样品量；相对灵敏度：仪器可同时检测的大组分与小组分的含量比值；分析灵敏度：输入仪器的样品量与仪器输出的信号的比值。

4灵敏度22第三节质谱仪仪器组成按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。第三节质谱仪仪器组成按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态23真空系统样品入口检测器数据系统质量分析器离子化方法大气

真空系统样品入口检测器数据系统质量分析器离子化方法大气241、进样系统进样系统的作用是高效重复地将样品引入到离子源中，并且不能造成真空度的降低。常用的进样装置有：间歇式进样直接探针进样色谱进样系统（GC-MS、HPLC-MS）高频感藕等离子体进样系统（ICP-MS）1、进样系统252.电离源将引入的样品转化成为碎片离子的装置。根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：气相源：先蒸发再激发，适于沸点低于500oC、对热稳定的样品的离子化，包括电子轰击源、化学电离源、场电离源、火花源；解吸源：固态或液态样品不需要挥发而直接被转化为气相，适用于分子量高达

105的非挥发性或热不稳定性样品的离子化。包括场解吸源、快原子轰击源、激光解吸源、离子喷雾源和热喷雾离子源等。硬源：离子化能量高，如EI。伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息；软源：离子化能量低，如场解吸源。产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量信息。因此，应根据分子电离所需能量的不同来选择不同电离源。2.电离源26

常见的几种离子化方式如下表常见的几种离子化方式如下表27电子轰击源(ElectronImpact，EI)作用过程：采用高速(高能)电子束冲击样品，从而产生电子和分子离子M+，M+继续受到电子轰击而引起化学键的断裂或分子重排，瞬间产生多种离子。水平方向：灯丝与阳极间(70V电压)—高能电子—冲击样品—正离子垂直方向：G3-G4加速电极(低电压)---较小动能---狭缝准直G4-G5加速电极(高电压)---较高动能---狭缝进一步准直--离子进入质量分析器。特点：使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结构简单，操作方便；但分子离子峰强度较弱或不出现（因电离能量最高）。电子轰击源(ElectronImpact，EI)28电子轰击源

式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子。

当电子轰击源具有足够高的能量时(一般为7OeV)，大多数化合物（电离能为10eV）分子不仅可能失去一个电子形成分子离子，而且有可能进一步发生键的断裂，形成大量的各种低质量数的碎片正离子和中性自由基，这些碎片离子可用于化合物的结构鉴定。电子轰击源式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子293、真空系统质谱仪中离子的产生及经过系统必须处于高真空状态。其中，离子源中的真空度：1.3×10-4-1.3×10-5Pa，质量分析器中的真空度：1.3×10-6Pa

一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。高真空的作用：

a）避免离子源灯丝损坏；

b）减少引起其它分子离子反应，避免质谱图的复杂化；

c）防止用作加速离子的几千伏高压引起放电。3、真空系统高真空的作用：30各类真空泵各类真空泵314、质量分析器

质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，它的功能是利用不同方式将样品离子按质荷比m/z大小分开。质量分析器的主要类型有：磁分析器（单聚焦质量分析器，双聚焦质量分析器）、飞行时间分析器、四极滤质器（即四级杆）等。4、质量分析器质谱仪的质量分析器位于离子源32（1）单聚焦质量分析器：它由单个扇形（90o或60o）或半圆形（180o）的均匀磁场组成。（1）单聚焦质量分析器：它由单个扇形（90o或60o）或半圆33单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器只是将m/z相同而入射方向不同的离子聚焦到一点（或称实现了方向聚焦）。但对于m/z相同而动能（或速度）不同的离子不能聚焦，故其分辨率相对较低，一般为5000。

单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器只是将m/z相同而入射方向34（2）双聚焦质量分析器：为克服动能或速度“分散”的问题，即实现所谓的“速度(能量)聚焦”，在离子源和磁分析器之间加一静电分析器（ESA），如下图所示，于两个扇形电极板上加一直流电位Ve，离子通过时的曲率半径为re=U/V，即不同动能的离子re不同，换句话说，相同动能的离子的re相同----能量聚焦了！

：

当离开入射狭缝的离子束在穿过静电分析器的环形通道时，离子所受到的向心力等于离心力时有：

所以，离子运动的轨道半径r可通过外加静电场来加以控制，只有动能相同的离子才能通过中间狭缝，实现能量聚焦。（2）双聚焦质量分析器：当离开入射狭缝的离子束在穿过静电35具有不同的方向，也就是说，发射角度不同具有不同的动能具有相同质荷比的离子在进入入射狭缝时可以采用单聚焦质量分析器聚焦于出射狭缝采用单聚焦质量分析器不能完全聚焦于出射狭缝要采用双聚焦质量分析器具有不同的方向，也就是说，发射角度不同具有不同的动能具有相同36

它是一种无磁动态质量分析器，根据不同质荷比的离子在无场分离区中的速度不同，引起漂移时间的差异来实现分离。（3）飞行时间质量分析器(TOF)反射型直线型飞行时间质量分析器它是一种无磁动态质量分析器，根据不同质荷比的离子在无场分37

如下图，由灯丝发射出的电子在电场作用下射向阳极，运动中央的电子在离子化区与气体分子碰撞并使之电离，在电子控制极上施加一个不大的负脉冲电压，引出离子化区中的正离子，在加速区上加直流负电压，使离子得到加速而获得动能，以速度v飞越长约1m的无场漂移区。直线型飞行时间质量分析器的工作原理如下图，由灯丝发射出的电子在电场作用下射向阳极，运动中38其速度v为：

由此可见，t取决于m/z的平方根之差。也就是说，离子的质量越小，运动速度越快，运行时间也就越短，也就越早到达接收器。此离子达到无场漂移管另一端的时间为：故对于具有不同m/z的离子，到达终点的时间差：其速度v为：由此可见，t取决于39（4）四极杆滤质器

它由四根互相平行的金属电极组成，如下图所示。在两个相对的极杆之间加电压(U+Vcos

t)，在另两个相对的极杆上加-(U+Vcost)。与前述双聚焦仪的静电分析器类似，离子进入可变电场后，只有具合适的曲率半径的离子可以通过中心小孔到达检测器。改变U和V并保持U/V比值一定，可实现不同m/z离子的检测。（4）四极杆滤质器在两个相对的极杆之间加电压(U+Vcos405、检测与记录质谱仪中常用的检测器有法拉第杯、电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。现代质谱仪中的检测器常采用电子倍增管。现代质谱仪的记录一般都采用较高性能的计算机对产生的信号进行快速接收与处理，同时通过计算机可以对仪器条件进行严格的监控，从而提高精密度和灵敏度。

5、检测与记录41碎片离子重排裂解碰撞裂解

设一有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子源，受到电子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子如下：举例：分子离子第四节质谱解析碎片离子重排裂解碰撞裂解设一有机化合物由A，B，C和D组42解析未知物的图谱，可按下述程序进行。第一步对分子离子区进行解析（推断分子式）（1）确认分子离子峰，并注意分子离子峰对基峰的相对强度比，这对判断分子离子的稳定性以及确定结构是有一定帮助的。（2）注意是偶数还是奇数，如果为奇数，而元素分析又证明含有氮时，则分子中一定含有奇数个氮原子。（3）注意同位素峰中M+1/M及M+2/M数值的大小，据此可以判断分子中是否含有S、CI、Br，并可初步推断分子式。（4）根据高分辨质谱测得的分子离子的m/z值，推定分子式。解析未知物的图谱，可按下述程序进行。43第二步对碎片离子区的解析（推断碎片结构）

（1）找出主要碎片离子峰。并根据碎片离子的质荷比，确定碎片离子的组成。常见碎片离子的组成见下表第二步对碎片离子区的解析（推断碎片结构）44（2）注意分子离子有何重要碎片脱去

（3）找出亚稳离子峰，利用m*=m22/m1，确定m1与m2的关系，确定开裂类型。（2）注意分子离子有何重要碎片脱去

（3）找出亚稳离子峰，利45第三步提出结构式根据以上分析，列出可能存在的结构单元及剩余碎片，根据可能的方式进行连接，组成可能的结构式第三步提出结构式46当前主要的高分辨仪器（HRGC/HRMS）生产商有3家，分别是沃特世（Waters）、赛默飞世尔科技（ThermoFisherScientific）、日本电子（JEOL）。第五节高分辨气相色谱/质谱联用仪当前主要的高分辨仪器（HRGC/HRMS）生产商有3家，分别47Waters简介沃特世(Waters)公司是全球最大的液相色谱、质谱及相关产品专业生产厂家之一，拥有实力最雄厚的研究机构和世界最大的色谱柱生产厂之一，是较早同时生产液相色谱仪器、化学品及数据处理系统三大液相色谱要素的厂商；Waters产品广泛应用于制药、生物技术、食品和饮料、聚合物、环境等各个领域，是较早能提供整体解决方案的供应商；

Waters公司高分辨仪器型号为WatersAutopremier。Waters简介沃特世(Waters)公司是全球最大的液相色48ThermoFisher简介赛默飞世尔科技是全球科学服务领域的领导者，在全球范围内服务超过35万家客户。客户包括医药和生物公司，大学、科研院所和政府机构等；旗下有ThermoScientific和FisherScientific两个品牌；赛默飞世尔科技进入中国发展已有30余年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、成都、沈阳等地设立了分公司，员工人数超过1400名，服务于第一线的专业人员超过800名

；ThermoFisher高分辨仪器型号为MAT95和ThermofisherDFS，MAT95为老型号产品，现在型号为ThermofisherDFSThermoFisher简介赛默飞世尔科技是全球科学服务领49JEOL简介日本电子株式会社（JEOL）是国际资深分析仪器生产商。JEOL目前面向中国及全球，生产销售各型扫描电子显微镜、透射电子显微镜、电子探针、扫描探针显微镜、X射线荧光光谱仪、核磁共振设备、质谱仪等设备；

在中国国内，众多重点实验室、科学院部门、科研所、大专院校、医疗机构、政府机构和企业单位都有JEOL的产品。日本电子在北京、上海、广州、武汉、成都设有办事处；

JEOL高分辨仪器型号为JMS-800D。JEOL简介日本电子株式会社（JEOL）是国际资深分析仪器生50产品特点

ThermoFisherDFS质谱部分：高性能的环形ESA静电场色谱部分：自己公司产品，双气相色谱进样方式接高分辨磁质谱耗电少：最大功率12Kw检测器：电子倍增管最小尺寸：3.14m*3.35m

WatersAutopremier质谱部分：由两个静电场和一个磁场组成三场EBE结构色谱部分：安捷伦公司产品7890变压器：英制设备需要变压器，但是比较小巧双GC接口，可同时进样，或交替进样检测器：光电倍增器

最小尺寸：4.5m*4.3m

JEOLJMS-800D质谱部分：EB两场结构色谱部分：安捷伦公司产品7890变压器：需要三台变压器体积较大检测器：光电倍增器最小尺寸：4.5m*4.5m产品特点ThermoFisherDFSWat51技术指标WatersAutopremierThermoFishersDFSJEOLJMS-800D技术指标WatersAutopremier52第六节质谱仪的临床应用蛋白质分析Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后产生的肽段

（从碱性氨基酸的羧基端切断）Myoglobin

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG第六节质谱仪的临床应用蛋白质分析Myoglobin用胰蛋白53胰蛋白酶酶切Myoglobin产生的肽段及其分子量

1811.90 GLSDGEWQQVLNVWGK1606.85 VEADIAGHGQEVLIR1271.66 LFTGHPETLEK1378.83 HGTVVLTALGGILK1982.05 KGHHEAELKPLAQSHATK1853.95 GHHEAELKPLAQSHATK1884.01 YLEFISDAIIHVLHSK1502.66 HPGDFGADAQGAMTK748.43 ALELFR

胰蛋白酶酶切Myoglobin产生的肽段及其分子量181154实际质谱分析所得的肽质量指纹谱GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKHGTVVLTALGGILKKGHHEAELKPLAQSHATKGHHEAELKPLAQSHATKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFR实际质谱分析所得的肽质量指纹谱GLSDGEWQQVLNVWG55实例：鼻咽癌病人血清标志物检测实例：鼻咽癌病人血清标志物检测56卵巢癌细胞培养液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS检测分析卵巢癌细胞培养液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS检测57MS/MS

串连质谱分析原理示意图MS/MS

串连质谱分析原理示意图58限制酶切蛋白质为肽段EnzymaticDigestandFractionation限制酶切蛋白质为肽段EnzymaticDigest59第一步MS分离各个肽段

第二步MS对其中的一个肽段进行氨基酸序列分析MS/MS第一步MS分离各个肽段

第二步MS对其中的一个肽段进行氨基酸60碰撞诱导解离CID中多肽分子结构中键断裂的多种可能性-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-RiCH-R’biyn-iyn-i-1bi+1R”i+1i+1