蛋白质的四级结构课件

蛋白质的四级结构课件蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级结构，分子中的每一个具有独立三级结构肽链,称为亚基亚基(subunit)2.维持蛋白质四级结构的作用力主要是疏水作用次级键盐键、氢键蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的第三节蛋白质结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（4对二硫键）为例说明第三节蛋白质结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象牛胰核糖核酸酶的变性与复性β-巯基乙醇尿素或盐酸胍透析有活性无活性牛胰核糖核酸酶的变性与复性β-巯基乙醇尿素或盐酸胍透析有活性1.一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同胰岛素的一级结构及种属差异（二）一级结构与功能的关系1.一级结构相似的蛋白质功能相似胰岛素的一级结构及种属差异（ACTH促肾上腺素皮质激素MSH促黑激素一级结构不同的蛋白质功能不同ACTH促肾上腺素皮质激素MSH促黑激素一级结构不同的蛋HbS与HbA的区别Β-亚基第6位氨基酸正常人：Glu患者：ValHbS与HbA的区别Β-亚基第6位氨基酸正常人：Glu患者：蛋白质的四级结构课件由4个亚基组成血红蛋白功能:运输O2由4个亚基组成血红蛋白功能:运输O2二、蛋白质空间结构与功能的关系（一）肌红蛋白Mb与血红蛋白Hb蛋白质的空间结构决定生物学功能肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（4个亚基）且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合二、蛋白质空间结构与功能的关系（一）肌红蛋白Mb与血红蛋白蛋白质的四级结构课件O2O2O2（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力O2（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力变构效应蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之变化的现象,称为变构效应协同效应蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合,称为协同效应促进正协同效应抑制负协同效应变构效应蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之血红蛋白与氧结合的正协同效应氧饱和度静脉血动脉血氧分压P50100%-HbMb血红蛋白与氧结合的正协同效应氧饱和度静脉血动脉血氧分压P50第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质（一）两性解离和等电点第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质（一）两性解蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H++OH-+H+pH=pIpH<pIpH>pI此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)等电点（pI）：在某一pH值溶液中，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体蛋白质的胶体原因：表面形成水化层表面同种电荷的斥力（二）蛋白质的胶体性质蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固变性后的蛋白称为变性蛋白质1.蛋白质的变性作用在某些理化因素作用下.蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作用(denaturation)概念:（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固变性后的蛋白称为变性蛋常见的变性因素：强酸、强碱、有机溶剂、尿素、胍、重金属生物碱、化学因素物理因素剧烈振荡热、紫外线、超声波、常见的变性因素：强酸、强碱、有机溶剂、尿素、胍、重金属生物碱变性蛋白质的主要特征:（2）生物活性丧失（4）变性蛋白质容易消化（1）蛋白质分子中的次级键断裂,构象破坏，但不涉及共价键的破坏,一级结构不变（3）变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、扩散系数减小变性蛋白质的主要特征:（2）生物活性丧失（4）变性蛋白质除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。蛋白质的沉淀(pre-cipitation)概念:应用:(1)蛋白质分离纯化(2)解毒(3)临床检验当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就(1)盐析法(saltingout)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法概念：特点：作用原理:盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力(1)盐析法(saltingout)向蛋白质溶液中加(2)有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀

必须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间

及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点：原理:常用有机溶剂:常会使蛋白质变性(2)有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀(3)重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：原理:重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的pH<pI，确保蛋白质以阳离子形式存在

缺点：原理:常引起蛋白质变性注意事项:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯3.蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果如加热可使蛋白质变为不容再溶解的凝块3.蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后二、蛋白质的分离纯化(一)盐析和有机溶剂沉淀(二)电泳(三)透析和超滤(四)层析(五)超速离心二、蛋白质的分离纯化(一)盐析和有机溶剂沉淀(二)分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：薄膜电泳、凝胶电泳……

（二）电泳概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动称为电泳。原理:不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度，从而达到分析和分离蛋白质的目的应用：电泳技术是生化常用分析技术之一分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：（二）电泳概念利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化，这种方法称为透析（三）透析利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)透析工作图半透膜原理透析工作图半透膜原理层析种类：凝胶过（分子筛）离子交换层析（阴离子和阳离子）亲和层析(四)层析层析种类：(四)层析带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换树脂工作示意图带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换树脂分子筛层析分子筛层析蛋白质的四级结构课件亲和层析工作示意图蛋白质载体介质配体结合洗脱洗脱介质亲和层析工作示意图蛋白质载体介质配体结合洗脱洗脱介质(六)超速离心(六)超速离心三、多肽链中氨基酸的顺序分析第一步：

分离提纯蛋白质，测定NH2末端的数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的，并分离出每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该肽链的氨基酸残基数。及每种aa的百分组成。一般过程：肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量÷120

（各种的氨基酸残基的平均分子量为120）再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸分离三、多肽链中氨基酸的顺序分析第一步：分离提纯蛋白质，测定a.丹磺酰氯法

丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。第二步测定肽链的氨基末端和羧基末端1.N末端的测定b.二硝基苯氟法：过时a.丹磺酰氯法第二步测定肽链的氨基末端和羧基末端1.2.C末端的测定常用羧基肽酶法羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析2.C末端的测定常用羧基肽酶法羧基肽酶专一地将肽链水第三步肽链的局部水解胰蛋白酶的作用原理1.酶解法第三步肽链的局部水解胰蛋白酶的作用原理1.酶解法CNBr与Met反应测定Pr的一级结构

2.化学法CNBr与Met反应测定Pr的一级结构2.化学法层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序第四步肽段氨基酸顺序分析一般采用Edman降解法弱碱条件异硫氰酸苯酯+N端α-氨基苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）酸性条件环化水解苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序第四步Edman降解法的示意图Edman降解法的示意图

一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于在不同部位断链，只要找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序第五步肽链一级结构的确定一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺则其氨基酸排列顺序为：

Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如测一个九肽测得N端氨基酸残基为Thr又分别测得片段:

Ala-Ala-Trp-Gly-Lys

Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白质的氨基酸顺序则其氨基酸排列顺序为：如测一个九肽测得N端氨基酸残