高通量药物筛选技课件

高通量药物筛选技术运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。高通量药物筛选技术运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛1分子生物学细胞生物学基因组学蛋白组学生物信息学结构生物学计算机辅助药物设计药物化学高通量筛选技术天然产物化学合成组合化学化合物库筛选模型结构优化先导化合物筛选—药物发现的关键环节

—高新技术集中的焦点分子生物学生物信息学高通量筛选天然产物化合物库筛选模型结构优2TheEvolutionofHTSTheEvolutionofHTS3高通量筛选的特点快速----每天筛选上万药次微量----筛选样品需要量为微克级灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性经济----筛选费用低高通量筛选的特点快速----每天筛选上万药次4高通量筛选的四个要素样品制备自动化HTS模型建立数据处理高通量筛选的四个要素样品制备自动化HTS模型建立数据处理5要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性6选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后7CurrentDrugTargetsMembraneReceptors 45%Enzymes 28%HormonesandFactors 11%IonChannels 5%DNA 2%NuclearReceptors 2%Unknown 7%N=483J.Drews,Science(2000)287:1962CurrentDrugTargetsMembraneR8克隆PCR、RT-PCR方法从cDNA文库、EST克隆、组织和细胞的总RNA中得到关键靶基因亚克隆大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫表达系统大规模表达、纯化、复性，得到纯净重组蛋白时间光吸收E412nm=13,600M-1cm-1检测方法的确定、优化及高通量筛选模型的建立分子水平筛选模型建立流程克隆亚克隆大规模表达、纯化、复性，得到纯净重组蛋白时间光吸收9模型设计体外生化检测通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等细胞水平的检测主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。模型设计体外生化检测10体外生化检测体外生化检测11显色反应

(Photometry)显色反应

(Photometry)12显色反应方法检测MetAP活性显色反应方法检测MetAP活性13显色反应方法检测MetAP活性显色反应方法检测MetAP活性14以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤：确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）天然或合成的底物的确定酶动力学信号窗口的评价对已知抑制剂的反应情况底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几15细胞水平检测细胞水平检测16荧光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。荧光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的17FLIPRfunctionalscreeningassayLGTPGDP

PLCinositolphosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescentsignalFLIPRfunctionalscreeningass18要素二：化合物样品库制备结构多样性（Chemicaldiversity）类药性（Drug-like)要素二：化合物样品库制备结构多样性（Chemicaldiv19Lipinski规则MW<500分子量ClogP<5计算疏水常数Hbonddonors<5H键供体Hbondacceptors<10H键受体Lipinski规则MW<500分子量20Propertiesofan“Average”DrugPropertiesofan“Average”Dru21UndesirableCompoundsUnstableReactiveMichaelacceptorToxicLiquidGeneralmetalchelatorPolyaromaticmetallocompoundUndesirableCompoundsUnstable22筛选样品来源传统化学合成、分离合成化合物分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位组合化学合成从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物库与其他机构的合作、交换或购买筛选样品来源传统化学合成、分离23传统化学合成和分离单个合成、分步纯化

一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高对特定的靶点SAR明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产生新的先导化合物传统化学合成和分离单个合成、分步纯化24发掘天然产物资源大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物的主要来源。经典方法---分离纯化、结构鉴定、活性测试---费时、效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研究中受重视程度。从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结构多样性大大高于组合化学，因而天然产物或天然来源的样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化学研究的新的切入点。发掘天然产物资源大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有25天然化合物库（NatureProductPool）尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似乎给我们这样一种信息：随着新的药物筛选模型的不断涌现，一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。天然化合物库（NatureProductPool）尽管许26天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣？天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物，特别是植物中的天然27为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：1）次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物；2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用已失去；3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没有任何真正的作用；4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生之前，次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在；5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，对生物体的生存具有重要作用。为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？化学家和生物化学家对28为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能；随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，每天可以筛选50000个以上的样品，为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法；天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易。为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？20世纪29天然产物研究的复活天然产物研究的成功天然产物研究的独特性新筛选方法的影响天然产物研究的复活天然产物研究的成功30根据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法天然材料的获得和提取有效的筛选方法天然生理活性物质的分离快速有效的结构解析方法生物学的评价天然生理活性物质的大量获得构效关系研究根据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法天然材料的获得和31天然产物或其类似物作为药品实例61%of877smallmoleculedrugsintroducedworldwideduringtheperiod1981-2002canbetracedto,orwereinspiredby,naturalproducts.天然产物或其类似物作为药品实例61%of877smal32洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）Compactin:R1=R2=HMevinolin:R1=CH3,R2=HSimvastin:R1=CH3,R2=CH3PravastatinFluvastatinCerivastinAtorvastin洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）C33环孢菌素A（CyclosporineA）真菌Trichodermapolysporum分离抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂环孢菌素A（CyclosporineA）真菌Trichod34紫杉醇紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是从太平洋红豆杉Taxusbrevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物。多西紫杉醇(2,Docetaxel,Taxotere)是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上，多西紫杉醇年销售额达到10亿美元以上。这两种药物已经成为当前，也是历史上最为畅销的抗癌药物。紫杉醇紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是从35喜树碱及其衍生物CamptothecinR1=R2=R3=HTopotecanR1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrinotecanR1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-AminocamptothecinR1=R3=H,R2=NH29-NitrocamptothecinR1=R3=H,R2=NO2(A)喜树碱及其衍生物是DNA局所异构酶Ⅱ(DNAtoposomeraseⅡ

抑制剂。喜树碱及其衍生物CamptothecinR1=R2=R3=36吗啡生物碱Morphine,R=HCodeine,R=CH3Buprenorphone,活性为Morphine25－50倍，成瘾性低于吗啡。Pentazocine,活性仅为吗啡的30％，但成瘾性极低吗啡生物碱Morphine,R=HBuprenorphone37天然产物研究的未来利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产物库”多样性导向合成(diversity-orientedsynthesis)天然产物研究的未来利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天38Galanthamine四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂及高尔基-质膜运输抑制剂SecramineA的发现ShairMDandKirchhausenT.Naturechemicalbiology,2006,2:39-462527compoundsweresynthesizedGalanthamine四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑39CompoundStorageSolidLong-termstorageDMSOsolutionLong-termstorage(10year?)WorkingsolutionsCompoundStorageSolid40CompoundplatesMotherPlatesDMSOsolutionsfromvendorsDaughterPlatesDMSOsolutions1mg/mlAssayPlatesAqueoussolutions25µg/mLcompound2.5%DMSO20µL80Compounds352Compounds88CompoundsCompoundplatesMotherPlates8041Samplemanagementtechnology化合物库是医药公司和研究机构最宝贵的资产。其数量和质量的重要性需要高可靠性的自动化储存和检索系统。专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品，包括：自动化的储存系统大型系统可储存60,000,000样品。储存环境温度可达到-80℃。自动化样品处理设备样品称量、溶解，微孔板间复制，封膜，Cherrypicking。软件储存系统控制软件，样品管理系统软件。耗材微孔板，微试管，封膜，Barcode.Samplemanagementtechnology化合42Samplemanagementtechnology瑞士Tecan公司的样品自动化储存系统产品ClicktoviewthevideoREMPLarge-sizestoreTM(LSS)Samplemanagementtechnology瑞士43要素三：自动化自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误差因素要素三：自动化自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误差因44微孔板（Microplate）

微孔板（Microplate）是许多方法和解决方案的最终决定因素。尽管近年来的芯片技术发展很快，但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不可替代的角色。正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行方式同时处理的概念，这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系统和工作站的快速发展。对于所有开发的仪器而言，微孔板是一个共同的标准，同时标准化的要求也增加了现代自动化系统的可靠性。其中，96孔板和384孔板都已经制定了相应的标准(SocietyofBiomolecularScreeningtaskforce"Standards"inAutomationandinstrumentation)。但是其他的高密度板，如864、1536、3456，甚至9600孔板目前还没有统一的标准。这些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本，同时增加了通量。

微孔板（Microplate）微孔板（Microplate45Microplates微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着筛选技术的发展而发展，包括：微孔板的颜色和材料微孔板微孔的设计和密度微孔板材料的表面处理Microplates微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着46MicroplatesfromCorningMicroplatesfromCorning47MatrixofWells864963841536 Well Row Column Volume 96 8 12 300 384 16 24 100 1536 32 48 10MatrixofWells864963841536 48Microplates微孔板的颜色和材料Microplates微孔板的颜色和材料49Microplates微孔板微孔的设计和密度微孔板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量。节约成本。提高筛选质量。Microplates微孔板微孔的设计和密度50Microplates微孔板材料的表面处理Microplates微孔板材料的表面处理51微孔板设备一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕微孔板而工作的，它们均可称为微孔板设备。独立单元（Stand-alone）：指象洗板器、液体分配器（LiquidDispenser）和酶标仪等工作站（Workstation）：能执行多重功能（通常指围绕微孔板）的部分，如液体转移装置（LiquidHandling）可围绕微孔板执行多重功能微孔板设备一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕微52History–1980’s,Zymark世界上第一台工作站是由Zymark公司开发的BenchmateTM系统，它集成了精密天平、单通道加液头、移液装置、振荡器和HPLC进样器等。通过一个机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个工作台，但这一系统主要是针对管形反应器设计而设计的，并不适用于今天的微孔板。History–1980’s,Zymark世界上第一台工53第一台基于于微孔板设计的工作站是由BeckmanCoulter开发的Biomek1000，它整合了单通道和多通道的吸液、加液、洗涤和单通道检测（密度测定）等组件部分。Biomek2000：

使用可变换工具后变得更加灵活，如不同的吸收器、分配器等。其特点是可以针对不同的需要设计不同的操作程序。BiomekFX：集成了更强大的功能，如多通道可同时、亦可执行不同的任务，双手臂操作则更是增加了有效性和操作速度。第一台基于于微孔板设计的工作站是由BeckmanCoult54Biomek®2000AutomationWorkstation

Biomek®2000AutomationWorkst55自动化液体分配装置自动化液体分配装置56检测系统UV-visibleLightAbsorbanceFluorescenceFluorescenceIntensityTime-resolvedFluorescence(TRF)FluorescencePolarization(FP)LuminescenceRadioactivity检测系统UV-visibleLightAbsorbanc57MicroplateReadersSpectraMaxPlus384

UVabsorbanceContinuous190-1000nm,Reads96wells,5sec;384wells,16secSpec