Expi293 细胞 Stable Pool 构建工艺操作规程

所属类别：稳定细胞株部文件编号：ACRO/QMS/GY/SCL-01文件名称：Expi293细胞StablePool构建工艺操作规程生效日期：2017.2.28编制：张雅慧编写日期：2017.2.25批准人职位：部门主管批准人：批准日期：2017.2.28文件类别：GY页数：3版本号：1.2控制级别：控制文件1目的规范Expi293细胞StablePool构建工艺操作规程。2适用范围本实验室Expi293细胞的StablePool构建实验。3适用责任稳定细胞株构建组所有成员。4原理外源基因导入到宿主细胞中，既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在，通过长时间的药物筛选，稳定表达抗性基因的细胞得以存活，成为优势细胞群，其子代细胞可在一段时间内高效表达外源基因，从而能较长时间高水平表达目的蛋白。此时构建的细胞株称为StablePool。5仪器设备及实验耗材超净工作台、离心机、水浴锅、细胞计数仪、计数板、电动移液器、移液管、无菌离心管、灭菌枪头。6试剂T17、Puromycin、Feedx、CM-19、0.2%台盼蓝7实验操作按《超净工作台使用与维护标准操作规程》正确进行超净工作台的杀菌和使用；转染操作需严格遵循《PEI瞬时转染Exip293F标准操作规程》；转染时细胞密度维持在1.8×106-2.2×106cells/mL，细胞活率95%以上，转染体积50mL即可满足需要；转染后20h-30h，进行细胞计数及荧光计数。要求此时细胞活率处于85%以上（若有荧光标记，荧光率需在25%以上）；细胞活率及荧光率如若不符合要求，不做后续操作，从步骤7.1开始重新转染；7.5药物筛选过程7.5.1配置培养基：吸取40mL-50mLT17至无菌摇瓶中，筛选药物为Puromycin，一般浓度为30ug/mL-60ug/mL（添加体积按照培养总体积计算），培养添加物为Feedx，添加体积为新鲜培养基总体积的5%，如若细胞有成团迹象，可添加1×CM-19（母液浓度一般为100×）。配置好培养基后，放入37℃水浴锅中进行温浴；7.5.2药物筛选以1.0×106cells/mL稀释药筛，依照细胞密度计算所需细胞液体积；7.5.3离心操作：离心机转速设置为750-800r/min，离心5min；7.5.4重悬操作：取10mL培养基重悬细胞沉淀至温浴好的培养基中；7.5.5隔天进行计数及离心换液操作。具体步骤同7.5.1&7.5.2&7.5.3&7.5.4。药物筛选第6天左右，细胞活率约为20%-60%（药物筛选活率最低点），活率低点受多种因素影响。在药筛期间密切观察细胞状态，药物筛选第10天左右，细胞活率缓慢恢复至60%-70%，细胞密度轻微增长，此时依然按1×106cells/mL进行稀释离心换液，通过计算，取一定体积细胞液进行离心换液。药物筛选第18天左右，细胞状态恢复正常。细胞倍增时间为25-30h，活率95%以上。7.6细胞库的冻存及初步表达量检测：细胞状态恢复后，进行5支一级库的冻存，同时进行SF250-50mLBatch的培养以进行初步表达量检测。培养时间为7-10天，期间进行2-4次5%Feedx的补料，若细胞成团，可添加1×CM-19（母液浓度一般为100×）。培养中后期进行3-5个样品的留样，送检QC。初步表达量评价后，进行10支二级库的冻存。7.7SCL部门生产验证：初步表达量结果进行初审后，若达到项目目标，视表达量及具体要求而定，进行200mL或者2L-1200mL的大体积生产验证培养，传递至纯化进行表达量的较准确判定及后续部门蛋白质量检测。培养时间为10天左右，期间进行2-4次5%Feedx的补料，若细胞成团，可添加一次或多次1×CM-19（母液浓度一般为100×）。培养中后期进行3-5个样品的留样送检QC。2L-800mL&2L-1200mL的具体培养参数如下：8注意事项：8.1离心换液吸取细胞沉淀时必须轻柔操作；8.2项目进行过程中转染后、药筛过程中、药筛结束时、细胞建库前至少进行4次无菌验证操作；8.3除细胞计数外所有实验过程要求严格无菌操作，一旦发现污染必须及时处理；9相关文件《SCL细胞转染记录》ACRO/QMS/GY/SCL01-R01《SCL悬浮细胞实验记录》ACRO/QMS/GY/SCL01-R02《SCL工作液配制记录》ACRO/QMS/GY/SCL01-R03《SCL质量检测报告》ACRO/QMS/GY/SCL01-R04《2L简易系统检测记录》ACRO/QMS/GY/SCL01-R05《SCL无菌验证操作记录》ACRO/QMS/GY/SCL01-R06日期更新内容更新后版本号更新人2016.5.1表头格式修改1.1