萃取技术-双水相萃取技术（药物分离纯化课件）

药物分离与纯化技术课程双水相萃取的应用大纲1.双水相萃取的应用3.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）2.双水相萃取的应用案例（1）产品的浓缩（2）蛋白质的提取和纯化（3）生物小分子的分离和纯化（4）中草药有效成分的提取（5）生物活性物质的分析检测

1.双水相萃取的应用双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）双水相分离条件（1）目的分子与细胞应分配在不同的相（2）分配系数应足够大（3）离心机容易分离

1.双水相萃取的应用双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）NaDS-硫酸葡聚糖双水相萃取的应用（1）分离和提纯各种蛋白质(酶）-α-淀粉酶的提取和纯化

用PEG/-(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从α-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶。

萃取最适宜条件：

PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,

α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。

2.双水相萃取的应用案例双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）（2）提取抗生素和分离生物粒子

采用PEG/Na2HPO4体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小试收率达69.2%,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.4%

2.双水相萃取的应用案例双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）（3）组合表面活性剂-盐萃取水杨酸和洛美沙星

采用聚乙二醇(PEG,M=1500)与聚乙烯吡咯烷酮(PVP,M=30000)组合表面活性剂-(NH4)2SO42H2O双水相体系萃取水杨酸和洛美沙星,两种药物的萃取率分别为大于90%和大于60%。按所采用的方法形成双水相体系,无需使用振荡器,操作简便,方法重现性好,可方便地进行连续萃取。

2.双水相萃取的应用案例双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）

（1）廉价双水相体系的开发

2.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）

体系优点缺点(PEG)/(dextran)盐浓度低活性损失小价格贵粘度大,分相困难(PEG)/盐成本低,粘度小活性损失大盐高,界面吸附多

变性淀粉PPT代替昂贵的dextran。PPT-PEG体系从发酵液中分离过氧化氢酶、β半乳糖苷酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定。和PEG-dextran体系非常相似

（1）廉价双水相体系的开发

2.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）优点：

(1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。

(2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。

⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg新的双水相体系如表面活性剂—表面活性剂—水体系、普通有机物—无机盐—水体系、双水相胶束体系等相继被发现，在双水相萃取中都显示出各自的优势。

（2）双水相萃取技术同其他分离技术结合

2.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）①双水相萃取同膜分离结合

双水相萃取同膜分离结合例子

（2）双水相萃取技术同其他分离技术结合

2.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）②双水相萃取同亲和层析相结合—亲和双水相

亲和双水相，即在PEG或dextran上接上亲和配基，使体系具有双水相处理量大的特点，且有亲和层析专一性高的优点。从亲和层析和亲和双水相在分离葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶时的结果对比中可以看出，无论在处理量上还是在收率上，亲和双水相都比亲和层析效果好

（2）双水相萃取技术同其他分离技术结合

2.双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）

②双水相萃取同亲和层析相结合—亲和双水相亲和层析和亲和双水相比较药物分离与纯化技术课程双水相萃取分离理论大纲1.双水相的形成2.双水相中的分配平衡3.双水相相图双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）（1）双水相

当两种高聚物的水溶液互相混合时，若两种被混合分子间存在空间排斥作用，使它们之间无法相互渗透，则在达到平衡时就有可能分成两相，形成双水相。

1.双水相的形成双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）

上相（或轻相）下相（或重相）（2）双水相系统

某些亲水性高分子聚合物或亲水性聚合物与无机盐之间，在水中超过一定浓度后可形成不相容的两相，并且两相中水分占很大比例的系统。

1.双水相的形成双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）（3）双水相形成的原因

主要取决于两种因素：系统熵的增加；分子间的作用力。熵的增加与分子数目有关，而与分子大小无关；分子之间的相互作用力可看作分子中各基团相互作用力之和，随分子量的增加而增加。分子量大的聚合物以摩尔计的相互作用能超过混合熵的增加而起主导作用，进而决定聚合物溶液混合发生的现象。当两种聚合物之间互不相容，而排斥，它们的线团结构无法互相渗透，导致一种分子为同种分子所包围，在达到平衡后，形成了互不相容的各自富含单一种聚合物的两相。

1.双水相的形成双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）

上相（或轻相）下相（或重相）（4）常用于分离的双水相系统PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)双聚合物：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)。该系统上相富含PEG，下相富含Dx；

双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）

聚合物与无机盐：聚乙二醇(PEG)/磷酸钾（KPi)。该系统上相富含PEG，下相富含KPi。1.双水相的形成2.双水相中的分配平衡溶质在双水相中的分配系数：影响分配系数的主要因素：溶质与双水相系统间的静电作用和疏水作用。其中：HF和HFS分别表示双水相系统和蛋白质的疏水性；

F、R和T分别为法拉第常数、气体常数和绝对温度；

Z为溶质的净电荷数；为相间电位。

C上——上相中溶质的浓度；C下——下相中溶质的浓度。

上相（或轻相）下相（或重相）双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）临界点双节线系线

在临界点处，分配系数为1TCB：双节线图中曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区

TMB：系线连接双节线上两点的直线。

3．双水相相图双水相萃取分离理论--双水相萃取技术（萃取技术）药物分离与纯化技术课程系线反映的信息:(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点），两相差别消失，成为均一相。(2)杠杆定则：同一系线上各点分成的两相，组成相同，体积不同。两相体积近似服从杠杆规则。(3)K(C)：临界点当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。

3．双水相相图(4)双节线的位置与形状与聚合物的相对分子质量有关药物分离与纯化技术课程双水相萃取过程大纲1.双水相萃取的工艺流程2.大规模双水相萃取及其简单设备双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）①操作条件温和②安全性能高③易于放大④操作方便⑤适于生物活性物质的萃取分离

1.双水相萃取过程

上相（或轻相）下相（或重相）双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）1.双水相萃取的工艺流程双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）1-细胞悬浮液；2-细胞破碎机；3-萃取器；4-聚乙二醇；5-无机盐；6-离心机；7-含目标产物的上清液；8-含细胞碎片的下相图1双水相分离细胞碎片和蛋白质的一般流程（1）目的物的萃取（2）PEG循环（3）无机盐的循环（1）目的物的萃取①如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取：是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相含目标产物。两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标。

1.双水相萃取的工艺流程双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）（1）目的物的萃取

②如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。

1.双水相萃取的工艺流程图2三步双水相萃取酶的流程示意图双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）（2）PEG循环PEG的回收有三种方法：①加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。③超滤

1.双水相萃取的工艺流程双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）（3）无机盐的循环

一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类。

1.双水相萃取的工艺流程双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）2.大规模双水相萃取及其简单设备图3两步萃取法连续分离胞内酶的流程示意图双水相萃取过程--双水相萃取技术（萃取技术）药物分离与纯化技术课程双水相萃取过程特点及影响因素分析双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）大纲1.双水相萃取过程2.双水相萃取的影响因素（1）过程

双水相的形成、溶质在双水相中的分配、两相的分离

1.双水相萃取过程

上相（或轻相）下相（或重相）双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）（2）双水相系统的选择

根据目标产物和杂质的性质差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物

1.双水相萃取过程

上相（或轻相）下相（或重相）双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）（1）成相聚合物

双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）2.双水相萃取的影响因素聚物类型、高聚物的平均分子量及浓度对双水相萃取都有影响例如：分子量：对于给定的双水相萃取系统，如果其中一种高聚物被较低分子量同种高聚物所代替，则被萃取的生物大分子物质将有利于在低分子量高聚物的一相富集。（1）成相聚合物

双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）2.双水相萃取的影响因素当接近临界点时，上相和下相的组成相同蛋白质均匀的分配于两相中，分配系数接近于1。当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别增大，蛋白质分子的分配系就会偏离临界点的值（=1），即大于1或小于1。（2）盐类的影响

在双水相聚合物系统中，加入电解质，首先阴阳离子会有不同的分配。

盐的正负离子在两相间的分配系数不同，由于各相应保持电中性，因而在两相中形成电位差，这对带电生物大分子的分配，产生很大的影响。

双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）3.双水相萃取的影响因素（2）盐类的影响

双水相萃取过程特点及影响因素分析--双水相萃取技术（萃取技术）3.双水相萃取的影响因素正离子分配系数K+负离子分配系数KK+0.824I-1.42Na+0.889Br-1.21NH4+0.92Cl-1.12Li+0.996F-0.912表1

一些无机离子的分配系数K-＞1分配在上相，K+≈1分配在下相注：双水