控制菌及螨类检查技术-药品中铜绿假单胞菌检查

项目九控制菌检查及螨类检查技术任务7药品中铜绿假单胞菌检查技能点3药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程1.实训目的掌握铜绿假单胞菌的检查程序及注意事项。2.实训要求2.1能按下达的任务要求，完成铜绿假单胞菌检查的试验设计。2.2能根据试验设计完成试验的准备及试验的具体操作。2.3能根据试验反应的结果做出正确的结论。3.仪器、设备和用具恒温培养箱、生化培养箱、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱、电冰箱、366nm紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程4.培养基和试液、指示液0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、1%盐酸二甲基对苯二胺试液、盐酸试液、氯仿、营养肉汤培养基、胆盐乳糖（BL）培养基、营养琼脂培养基、溴代十六烷基三甲胺、绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）、明胶培养基、硝酸盐胨水培养基。对照用菌液铜绿假单胞菌营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。5操作方法5.1供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.2供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。5.3增菌培养取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。5.4分离培养轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.5纯培养供试品分离平板生长6.4所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查。5.6革兰染色镜检5.6.1革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。5.6.2镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。5.7生化试验用铜绿假单胞菌做生化试验的阳性对照株。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.1氧化酶试验取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30s内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。本操作应注意：试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反映不可靠。试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外）挑取菌落（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯而胺氧化变色不可用。反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性范性。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.2绿脓菌素试验取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，36℃±1℃培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿3～5ml，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在氯仿液内。静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol/L）约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的PDP琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1～2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.3硝酸盐还原产气试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h，观察结果。如在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。5.7.442℃生长试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯化钠液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置42℃±1℃的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24～48h，斜面如有菌苔生长者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.5明胶液化试验以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于36℃±1℃培养24h。取出放入0～4℃冰箱内10～30min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝固状，为阴性反应。本试验应注意：（1）本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。（2）试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程6结果报告6.1供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。6.2供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。6.3

凡与7.1与7.2结果不符合报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程7注意事项7.1污染铜绿假单胞菌的药物，因生产工艺和药物的影响，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态可产生非典型形态。为防止漏检，在挑取疑似菌落时，宜取2～3个以上菌落，分别进行检验，以提高铜绿假单胞菌的检出率。7.2

绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测试，选用适宜品牌，试验时并用阳性菌株作对照试验。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程项目九控制菌检查及螨类检查技术任务7药品中铜绿假单胞菌检查知识点7药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌为假单胞菌属的模式种。本菌首先从临床样本中分离所得，该菌感染使脓汁呈铜锈样的蓝绿色，故命名为铜绿假单胞菌，习称绿脓杆菌。此菌广泛分布在土壤、水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。本菌是常见的化脓性感染菌，在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗难度，国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。铜绿假单胞菌按增菌、分离、纯培养，革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。7.1.1形态特征

铜绿假单胞菌为革兰阴性、直或微弯曲的杆菌，无芽孢，无荚膜，有1～3根的单端鞭毛，运动活泼。药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1.2培养特征

铜绿假单胞菌除在硝酸盐培养基中以外都是专性好氧。最适生长温度为35℃，在含硝酸盐和亚硝酸盐培养基中于42℃能发育生长是本菌的特点之一。此菌营养要求不高，基本培养基生长良好，因是专性好氧菌，在培养基表面生长较旺盛，在液体深部发育不良，在条件适宜的营养肉汤培养基中生长迅速，24h液面出现菌膜，菌液表面呈现蓝绿色或黄绿色水溶性色素，本菌能产生水溶性绿脓色素与荧光素；在固体培养基上形成湿润，扁平，边缘不整齐，较大的菌落，并具有生姜味。在血平板上大多数菌株能形成溶血环。7.1.3生化反应

铜绿假单胞菌能分解葡萄糖。产酸不产气，不分解乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。基质试验-，尿素酶+，氧化酶+，硝酸盐还原产气试验+，枸橼酸盐利用试验+，不产生H2S，液化明胶试验+。药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1.4抵抗力

铜绿假单胞菌对热抵抗力不强，56℃30min可被杀死。在1%石炭酸、0.2%甲酚皂溶液处理5min可将其杀死。对青霉素，链霉素等不敏感，对新霉素、庆大霉素、多黏菌素B轻度或中度敏感，但易产生耐药性。本菌对十六烷三甲基溴化铵有抗性，故可用于该菌分离。此外本菌在陈旧培养物极易死亡，保存时须注意。7.2检查程序供试液的制备见“药品中微生物总数的检查。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查，阳性对照试验应检出相应的控制菌。阳性对照试验的目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。药品中铜绿假单胞菌检查方法阴性对照试验：取稀释剂10ml加入100ml(或200ml)相应控制菌检查用的增菌培养基中。培养，应无菌生长。阴性对照试验目的：检查稀释剂是否满足无菌要求及培养条件是否适宜。7.2.1增菌培养

胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml(相当于供试品1g或1m)；1份加入供试液及阳性对照菌；1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照,于36℃±1℃培养18-24h(必要时可延至48h)。阴性对照菌应无菌生长。7.2.2分离培养

轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环沾取1-2环培养液(如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18-24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和黏液型等，应注意挑选。药品中铜绿假单胞菌检查方法7.2.3纯培养

供试品分离平板生长所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种于营养琼脂斜面，培养，做以下检查。7.2.4革兰染色镜检(1)革兰染色

见大肠埃希菌检查。(2)镜检

铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个、成对或成短链排列。7.2.5生化试验

用铜绿假单孢菌做生化试验的阳性对照株。7.2.5.1氧化酶试验

取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加一滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二试胺试液、在30内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。药品中铜绿假单胞菌检查方法本试验应注意：7.2.5.1.1试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠；7.2.5.1.2试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针(环)(白金材料除外)挑取菌落(苔)，否则易出现假阳性，宜用玻棒或木棒；7.2.5.1.3试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。7.2.5.1.4反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阳性反应；7.2.5.1.5麦康凯、SS琼脂培养基等含糖培养基上的菌落，不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸，抑制氧化酶活性。7.2.5.2绿脓菌素试验取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，36℃±1℃培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加三氯甲烷3-5ml，以无菌玻搅碎培养基并充分振摇，使培养物中的药品中铜绿假单胞菌检查方法色素完全萃取在三氯甲烷液内。静置片刻，待三氯甲烷分层，用吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液(1mol/L)振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的PDP琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1-2天再按上法试验。凡经再次检验