无菌检验技术-供试品的无菌检查

项目七无菌检验技术任务4供试品的无菌检查技能点5薄膜过滤集菌器操作规程5.膜过滤集菌器操作规程5.1目的：为了规范、统一无菌检查方法，确保微生物检测准确、安全进行，建立薄膜过滤法操作规程。5.2范围：本规程适用于2015版中国药典注射剂的无菌检查。5.3职责：质检室质检员负责本操作规程的执行，质保室质监员负责本操作规程的监督检查。5.4内容：5.4.1薄膜过滤法薄膜过滤法是将供试品通过集菌仪的定向蠕动加压作用，实施正压过滤并在滤器内进行培养，以检验供试品是否含菌的方法。

薄膜过滤集菌器操作规程膜过滤集菌器装置图薄膜过滤集菌器操作规程(1)薄膜过滤法的简要方法供试品通过进样管连续被注入集菌仪培养器中，利用集菌培养器内形成的正压，通过不大于0.45μm孔径的滤膜过滤，供试品可能存在的微生物被截留收集在滤膜上，通过冲洗滤膜除去抑菌成分；然后把所需培养基通过进样管直接注入集菌器培养器中，放置在规定的温度下培养，观察是否有菌生长。该方法适宜抗菌药品的无菌检查。（2）操作步骤①供试液的配制(同直接接种法)按无菌操作取出规定量的供试品，用适宜的溶剂溶解、稀释到规定的浓度：吸取适量供试品药液，加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至100m1(供试液)，摇匀。薄膜过滤集菌器操作规程②过滤启动蠕动泵，过滤。如采用开放式过滤装置，打开滤器盖，在火焰旁无菌操作立即将供试液倒入直径约为50m、孔径不大于0.45μm微孔滤膜的薄膜过滤器中，关闭滤器盖，打开排液架阀门，启动真空泵进行减压抽滤，滤干。③冲洗用灭菌0.9%氯化钠溶液或其他适宜的溶剂照上述操作冲洗滤膜不得少于3次，每次100ml。冲洗次数应由验证试验确定，至阳性对照菌正常生长。大容量非抗菌作用的供试品，薄膜过滤后，无须冲洗。

薄膜过滤集菌器操作规程④接种、培养如用全封闭式过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。集菌培养器底部的排液管口拧上，将冲洗液瓶取下换上相应的培养瓶，启动电源，将培养基泵人指定的培养器内，关闭电源。将已操作完毕的含培养基的集菌培养器移出无菌室，取其中一管作为阳性对照，依阳性对照菌选择原则加入相应的对照菌液。薄膜过滤集菌器操作规程如用传统开放式过滤器，过滤后，打开抽气瓶塞排气管的螺旋夹，将过滤器取下取出滤器的玻璃筒，用灭菌镊子将滤膜放入灭菌的平皿中。用灭菌剪刀将滤膜平均分成4份，用灭菌镊子取3份分别放入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基管各1份。阳性对照管应根据供试品的特性加入相应对照菌，如抗细菌药物，以金黄色球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠为对照菌。每次操作时,均应取相应溶剂、稀释剂及冲洗液同法操作，作为阴性对照

所有供试组、阳性对照组、阴性对照组都要按规定温度与时间培养、观察。

⑤结果判定同直接接种法。薄膜过滤集菌器操作规程项目七无菌检验技术任务4供试品的无菌检查技能点4直接接种法操作规程4.直接接种法操作规程4.1目的：为了规范、统一无菌检查方法，确保微生物检测准确、安全进行，建立直接接种法操作规程。4.2范围：本规程适用于2015版中国药典注射剂的无菌检查。4.3职责：质检室质检员负责本操作规程的执行，质保室质监员负责本操作规程的监督检查。4.4内容：4.4.1直接接种法直接接种法即取规定量的供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中供试品的体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基装量不少于10ml。

直接接种法操作规程4.4.2实验前的准备①无菌室内应准备好消毒溶液、乙醇灯、火柴、镊子、75%乙醇棉、记号笔等。②供试品在移入缓冲间前应除去外包装、消毒外表面并编号。③将已灭过菌的注射器及针头，15ml硫乙醇酸盐流体培养基11管培养基管，10ml改良马丁培养基10管，经外包装消毒后，连同其他用具（包括无菌衣，帽、口罩等）移入缓冲间。④开启操作间紫外灯和空气过滤装置并使其工作1h以上。⑤操作人员用肥皂、水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用75%乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩、手套。将所需物品剥去牛皮纸，移入无菌间每次试验中所用物品必须计划好，并有备用物品。

直接接种法操作规程4.4.3供试品的制备在无菌室内，先用75%乙醇或碘仿棉球擦试供试品内包装壁及瓶塞，待干，以无菌的方式取内容物，制成一定浓度的供试品溶液。①当供试品为粉针剂，瓶盖为橡胶塞时，用注射器吸取规定的溶剂，在已消毒好的橡胶塞中心位置刺入小瓶加入溶剂，溶解，混匀后吸出溶液，或选用其他适宜的方法制成一定浓度的供试品溶液。②如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂成灭菌溶液等可用注射器吸取药液或选用其他适宜的方法制成一定浓度的供试品溶液。③按规定或需灭活的供试品可用灭活剂溶解，将瓶内供试液抽出稀释至规定的浓度。直接接种法操作规程供试品如为注射用无菌粉末的原料药(大包装粉针剂)，为缩短取样时的暴露时间，应由两人按无菌操作开启容器取出内容物，再用适当溶剂制成一定浓度的供试品溶液。注意：供试品处理时所用的溶剂、乳化剂、分散剂、中和剂(灭活剂)及其用量应验证是有效的，并对微生物生长无影响。⑤抗菌类药物及含防腐剂药物，即有抑菌作用的供试品，可先用中和法、灭活法能或稀释法使其不再具有抑菌作用，再用直接接种法检查。直接接种法操作规程中和法(灭活法)：在培养基中加入合适的中和剂，使药物不再具有抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不计，如对青霉素药物进行无菌检查时，常在培养基中加入中和剂青霉素酶。中和剂本身必须对微生物没有毒性，同时灭活剂与抗菌药物相互作用的产物对微生物也没有毒性。灭活剂的中和作用必须迅速而完全。稀释法：有些供试品有抑菌作用或含有抑菌作用的物质而没有适当的中和剂，可加入较大量的培养基，使供试品稀释至不具抑菌作用的浓度即可。亦可按薄膜过滤法检查。

直接接种法操作规程4.4.4供试品无菌检查的接种①硫乙醇酸盐流体培养基接种按无菌操作取上述制备妥的供试品1ml，沿着培养基管壁分别接种于装有15ml硫乙醇酸盐流体培养基11管，其中1管在操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液lml作为阳性对照，置30-35℃，培养14天。②改良马丁培养基接种取上述制备好的供试品lml，沿着培养基管壁分别接种于10ml改良马丁培养基10管，轻轻摇动使匀，于23～28℃，培养14日。③阴性对照每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂，同法操作，作为阴性对照。直接接种法操作规程(4)培养及观察培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长、填写检查记录表，阳性对照管培养24后应有菌生长。如加入供试品后的培养基在培养过程中出现浑浊培养14日后，不能从外观上判断有微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养48h，真菌培养72h，观察是否再现浑浊成斜面上有无菌生长；或用接种环取培养液涂片，染色，显微镜下镜检，进行判断是否有菌。(5)结果判定当阳性对照管浑浊并确定有菌生长，阴性对照管无菌生长时，方可据所观察到的结果判定。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判断供试品符合规定若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。直接接种法操作规程当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效。①无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。②回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；③供试品管中生长的生物经定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

直接接种法操作规程项目七无菌检验技术任务4供试品的无菌检查知识点4供试品的无菌检查供试品的无菌检查4供试品的无菌检查4.1检验数量从理论上讲，无菌产品应当是没有任何的微生物污染的产品，由于产品的无菌检查方法是破坏性的，所以不可能对每批的产品一一进行检查，因此，一般都是从每批产品中抽取一定量的样品进行无菌检查，以此结果判断每批产品是否符合无菌的要求。另外，由于无菌产品的污染率极低，因此抽样方法和检验数量直接影响着无菌检查的结果。检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。检验数量的多少受很多方面因素的制约，例如检查的目的、要求、代表性及抽样方法以及实际工作量和经济损失等因素。供试品的无菌检查《中国药典》2010年版规定：除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。一般情况下，供试品无菌检查若用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。总之，检验数量力求以最少样本量准确反映总体的质量。《中国药典》2010年版关于检验的数量与国外药典基本一致，对于生产厂的出厂产品加大了检验量：但药检部门的监督检查的抽样量仍较少，与国外水平存在差距。供试品的无菌检查表1批出厂产品最少检验数量供试品批产量N（个）接种每种培养基所需的最少检验数量小体积注射剂（≦100ml）≦10010%或4个（取较多者）100﹤N≦50010个﹥5002%或20个（取较少者）大体积注射剂（﹥100ml）2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品≦2005%或2个（取较多者）﹥20010个桶装固体原料≦4每个容器4﹤N≦5020%或4个容器（取较多者）﹥502%或10个容器（取较多者）抗生素原料6个容器医疗器具≦10010%或4个（取较多者）100﹤N≦50010个﹥5002%或20个（取较少者）供试品的无菌检查表2液体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验量供试品装量V（ml）每支供试品接入每种培养基的最少量供试品最少检验数量（瓶或支）≤1全量101﹤V﹤5半量105≤V﹤202ml1020≤V﹤505ml1050≤V﹤10010ml1050≤V﹤100（静脉给药）半量10100≤V﹤500半量10﹥500500ml10供试品的无菌检查4.2检验量检验量是指一次试验所用的供试品总量(g或ml)。除另有规定外，每份培养基的供试品量按表2、表3规定。若每支(瓶)品的量按规定足够接种两份培养基则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。以欲检查上市产品青霉素钠注射剂为例，参照表表3，每支供试品接入每种培养基的最少量为150mg，供试品最少检验数量为10支。但由于青霉素为抗生素，应采用薄膜过滤法，将每支全部内容物过滤冲洗。供试品的无菌检查4.3阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用(如维生素B12注射液)及抗革兰阳性菌(如