淮北地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

淮北地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

铜绿假单胞菌（pa）是医院感染的常见病原体。然而，临床分离药物的耐药性越来越严重，对临床抗感染化疗的研究也越来越重要。碳青霉烯类抗生素是目前临床上治疗铜绿假单胞菌感染最好的药物之一。近年来,国内外文献报道铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药呈逐渐上升趋势1材料表面1.1临床菌株鉴定25株Pa来自2007年1月～2008年6月淮北矿工总医院、淮北市人民医院、皖北煤电集团总医院临床微生物室,所有菌株均采用法国梅里埃VITEK-32全自动微生物系统鉴定到种。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心,产IMP-1、VIM-2型酶铜绿假单胞菌由安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏教授惠赠。1.2细菌总dna提取系统PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司产品);电泳仪(北京六一仪器厂);紫外凝胶电泳成像分析系统由安徽医科大学第一附属医院提供。细菌总DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司);DNAMarker(上海天根化工有限公司),M-H琼脂、肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司);引物由中山大学达安基因股份有限公司合成,测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。2方法2.1菌株筛选及质控菌株采用K-B法和MIC法测定12种抗生素的敏感性,质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。药敏判断标准按2006年版CLSI规定执行。2.2dna提取采用德国QIGEN公司提供的小量DNA提取试剂盒提取,抽提好的DNA模板对倍稀释后于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,以确认DNA提取效果,置-20℃保存备用。2.3抗癫痫基因的检测参照国内文献设计引物2.4金属酶检测2.4.1冻融法制备液将已经分纯的新鲜待检菌密布于1/4块MH平皿,35℃孵育24h,全部取下置于备好的5mL胰蛋白胨水中35℃温箱过夜培养。4000rpm离心20min,弃上清,沉淀置-80℃冰箱反复冻融8次,加0.1mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液2mL,混匀,4℃15000rmp离心30min,取上清液进行无菌试验,其余留-20℃保存备用。无菌试验阴性,即可作为酶粗提液。2.4.2亚胺培南药敏纸片的检测将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922接种于MH平板表面,平板中心贴10μg/片的亚胺培南药敏纸片,在距纸片边缘0.5～1.0cm两边挖两个槽,于槽内分别加40μL酶粗提液、酶粗提液+2-巯基丙酸(30μL酶粗提液+10μL2-巯基丙酸)35℃培养过夜,平板上出现矢状生长即为阳性。阳性对照为IMP-1、VIM-2型铜绿假单胞菌。2.5序列测量和分析扩增后PCR阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序,所得测序结果采用GenBank中的BLAST程序进行比对。3结果3.11种抗菌药的耐药率及抗菌性能25株亚胺培南耐药Pa对临床常用抗生素耐药情况非常严重,除对复方制剂哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为40%、44%以外,对其他抗菌药物的耐药率均超过了50%,12种抗生素药敏结果见表2。3.2金属酶表型筛选的结果改良三维试验筛选出9株阳性,占36%。3.3基因检测2有15株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌经OprD2引物扩增结果为阴性,表明该15株Pa外膜蛋白oprD2缺失,缺失率60%。3.4酶抑制剂的检测有4株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌经VIM引物扩增阳性,1株经IMP引物扩增阳性,VIM-2的检出率为16%,IMP-1的检出率为4%,未扩增出GIM和SPM-2基因。部分相关耐药基因电泳图见图1、图2。3.5基因测序分析本研究对5株金属β-内酰胺酶基因扩增产物进行测序分析:1株IMP型基因扩增产物经测序,测得序列经BLAST比对分析其核酸序列与GenBank已登陆的IMP-1序列(注册号:DQ42025)同源性为99%,在306位出现终止密码子;4株VIM型基因产物经测序,BLAST比对分析为VIM-2型,同源性100%(注册号:EF693947)。IMP-1基因PCR产物测序图见图3,VIM-2基因产物测序图见图4。4外膜蛋白缺失微孔蛋白是位于细胞膜上的特殊载体蛋白,能对特定的底物进行主动转运。与碳青霉烯类抗生素耐药有关的微孔蛋白主要有特异性孔蛋白如OprD。OprD表达增加,可使亚胺培南以及第四代头孢菌素的转运升高,从而使铜绿假单胞菌对其敏感性增加,反之,则使细菌对其敏感性下降。OprD种类较多,其中OprD2是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素(美罗培南除外)进入菌体内的特异性通道。其它的β-内酰胺类抗生素如头胞菌素类、青霉素类等不能通过OprD2通道,所以碳青霉烯类抗生素与其它β-内酰胺类抗生素之间无交叉耐药性。本研究中,经OprD2引物扩增有15株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白缺失,占60%。说明外膜蛋白OprD2缺失是淮北地区对亚胺培南耐药的重要机制之一。此报导与国内其它地区有所不同金属酶是近年来引起铜绿假单胞菌多重耐药的重要机制之一,金属酶属于Ambler分子分类的B类。金属β-内酰胺酶基因位于染