6种真菌多糖含量测定方法的比较

6种真菌多糖含量测定方法的比较

比色法是一种传统的糖含量测定方法。基本原理是用硫酸或盐酸处理糖，将糖从ph值中脱水，生成抗胆红素或衍生物，然后测量反应溶液的吸收值，并将标准曲线结合起来测定糖。在以上比色法中,最常用的是苯酚-硫酸法,其稳定性、精确性要明显优于其它两种。于村等人比较了蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、直接滴定法对香菇多糖含量的测定在对反应液的吸光值测定时,最常用的是紫外可见分光光度计法,该方法精密度高、重复性好、操作相对简单肖建辉1材料和机器1.1材料表面1.2试剂葡萄糖、苯酚、浓硫酸(分析性纯,天津市永大化学试剂有限公司)1.3仪器和设备KQ5200型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;QT-1漩涡振荡器,郑州南北仪器设备有限公司;TDL-5-A离心机上海安亭科学仪器厂;MultiskanFC酶标仪,热电公司。2测量2.1测定细菌中的糖含量2.1.1糖提取多糖的提取参照农业行业标准NY/T1676~2008进行2.1.2苯酚溶液的制备0.1mg/mL葡萄糖标准溶液的配制:称取0.1000g烘至恒重的葡萄糖,加水溶解,定容至1000mL,置于4℃冰箱中贮存。显色反应:分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中,用去离子水补充至1.0mL。向试液中加入5%的苯酚溶液,然后迅速加入5.0mL浓硫酸(与液面垂直加入,勿接触试管壁),静止10min,使用漩涡振荡器充分混合,将试管置于30℃水浴锅中反应20min,使用酶标仪490nm下测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,制定标准曲线。2.1.3样品测定吸取提取液1.0mL于20mL具塞试管中,按照上述方法进行显色反应,于490nm下测定吸光度,结合标准曲线计算多糖含量。2.1.4计算公共格式W—样品中多糖的百分含量,单位,%;m2.2方法评估2.2.1葡萄糖含量的测定葡萄糖标准储备液:将0.1mg/mL葡萄糖标准液依次稀释成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的储备液实验方法:分别取某样品提取液和6个梯度的葡萄糖储备液1mL进行显色反应,在0~120min内,490nm下测定吸光值,计算葡萄糖含量。2.2.2葡萄糖含量测定实验方法:分别取某样品提取液、0.04mg/mL葡萄糖储备液各6份,每份1mL进行显色反应,490nm下测定吸光度,计算葡萄糖含量。2.2.3加标回收率的测定实验方法:共7组实验,每组加0.5mL的某样品提取液,然后分别加0.5mL的去离子水、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL葡萄糖贮备液,进行反应,490nm下测定吸光度,计算回收率。3结果3.1样品的选择和快速采集从实验结果来看,线性方程的R实际测定时,包括平行在内,待测液有十几个,用分光光度计时需要不断的更换、清洗比色皿,同时由于使用苯酚和浓硫酸硫酸,又容易损伤皮肤,而选用酶标仪时,使用移液枪精确吸取即可,实验的危险性降低,同时样品可快速测出。3.2试验方法的评估结果3.2.1系统误差的测定根据测定的各溶液显色反应后的吸光值,计算各溶液中的葡萄糖含量,然后计算各组的SD值及RSD值,结果见表1。实验结果表明,在2h内,只有0.01mg/mL的储备液这组的RSD值稍高,为3.918%,实验过程中这几个浓度都是在同一条件下进行的,该组较大的误差应该属于系统误差。其各组的RSD值均小于5%,说明酶标仪测定出各溶液的吸光度是稳定的,该方法的稳定性比较高。3.2.2葡萄糖含量的测定根据测定的吸光值,计算提取液显色后、葡萄糖储备液中的葡萄糖含量,结果见表2。从实验结果来看,6组重复下的实验结果很接近,且RSD值均小于5%,说明该方法具有良好的重复性。3.2.3加标回收率实验根据测定的7组吸光值,计算各组的糖含量,进一步计算各做的回收率,结果见表3。7组加标回收率实验的平均值为99.29%,RSD为2.105%,说明这种方法有较高的回收率,准确度较高。通过以上稳定性、重复性、加标回收率实验的结果可以看出,酶标仪法具有较高的稳定性、重复性和回收率,这种方法应用于测定多糖含量,有较高的准确性。3.3样品测定结果4方法的精密性实验和使用酶标仪的方法通过以上实验可以看出,酶标仪和紫外可见分光光度计一样都可用于多糖含量测定,而酶标仪与分光光度计相比,有更多的优势,如:可以同时测定多个样品,避免不断更换、清洗比色皿的繁琐操作等。通过精确性实验,也可以看出酶标仪在测定数据时具有高稳定性、重复性、回收率,表明用酶标仪完全可以代替紫外可见分光光度计,用于多糖含量的测定,同时酶标仪的使用,使实验更为快捷、简便。香菇、平菇、金针菇、白灵菇、杏鲍菇、双孢菇,购自本