单胞藻培养管理(生物饵料培养课件)

二级培养室01生产中常用的培养容器02透明尼龙袋03白色塑料桶光反应器透明尼龙袋一般用透明农用薄膜制成，大小不等，袋口用1根直径为3~5cm，长10~15cm的硬性塑料管固定，充气管和气头从中经过。尼龙袋最好一次性使用。二级培养室白色塑料桶容量大小以50L为宜，桶的上方用电烙铁钻1个小孔，孔径大小以充气管通过即可。桶口盖一层消毒过的透明尼龙薄膜，再用圆松紧带扎口，便于透光。一般育苗厂最好配备200~500只，可以消毒后反复使用。二级培养室光反应器容量大小20~50L，可半连续培养。二级培养室

三级培养室在生产中配有培养池、砂滤装置、消毒池等。（1）培养池。培养池一般20~40只，以面积15~25m²、池深0.8~1m为宜。可采用混凝土现浇池，也可采用预制块砌、砖砌，混凝土外涂。

三级培养室（2）砂滤池与砂滤罐。自海区抽人的海水，首先在沉淀池沉淀24h后，经砂滤或过滤装置以除去水中主要的生物或非生物的颗粒性杂质，再经过陶瓷过滤罐，除去做小的生物、通常采用二级砂滤池进行水的过滤。

三级培养室（3）消毒池。微藻生产性培养的用水，常用漂白粉处理，杀死水中的微生物。这种化学药物消毒海水的方法需要有2~3个专用海水消毒池，交替消毒和供水。

三级培养室采集水样可取自天然水域，开敞的水面或小港湾皆可采集。采样场所甄选可留意海岸上存留的小水洼。有一段时间和大海隔绝的小水洼，往往生长有适于静水体培养的藻类，种类单纯，容易分离。采样场所甄选培养水生生物或贮水的容器、水池，也是采样的理想场所。如要分离底栖微型硅藻，可刮取潮间带的“油泥”，过滤即可获得浓度很高的藻细胞水样。采样场所甄选此外，也可以把附着在大型藻类如海带、马尾藻等藻体，或其他物体上的附着藻类洗刷下来用作分离的水样。采样场所甄选（2）（3）（4）藻种收集藻种保存

（1）藻种选种

藻种处理

藻种分离生长迅速，无毒性，且易于收获。A对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；B蛋白质，脂类和糖类含量高，或有选择地积累一种特殊的代谢产物（如甘油）。C所选择的生物种应具有下列特征：一、选种1.选种的意义选择出合乎人们生产需要的优良品种。2.选育种的方法选择育种在单细胞藻类生产的过程中，不经过人为的处理而是利用其自然发生变异，有目的地、定向地把具有符合生产要求的优良性状（生活力强、生长快、繁殖快、耐高温等）的藻种留下进培育。诱变育种通过诱变剂处理（亚硝酸、钴60、快中子、氯化锂、紫外线等），使藻细胞发生大量变异从中选出具有优良性状的变异个体。3.接种的方法液体接种将藻液直接加入培养液中进行搅拌，加入的藻种分量视水温而定，水温较低（<10℃）时多加，约占培养液总量的30～40％左右；水温适宜时（25～30℃），可加5～8％左右。干藻接种干藻的藻体接种，接种量为0.1～0.2％。二.藻种收集纯种培养单种培养排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。二.藻种收集采集藻类要以各种藻类的生态环境、生活习性为基础。藻类主要分布在水中，如湖、河、海洋，可分为固着、漂浮、浮游三类。在陆地潮湿处也有分布。从气候条件看，一般在温暖季节，藻类的种类和数量较多。有一些种类如蓝藻在气温较高时生长特别繁盛；也有些种类如硅藻、甲藻在气温凉爽时较多。在不同环境条件中，藻类的组成成分是不同的,采取不同方法。03浮游藻类着生藻类

01漂浮藻类02对于生长在其他物体上较大型藻类，一般用手或镊子采取。应尽可能采取整个植物，包括它们的基部或着生部分。生长在土壤上的，最好用刀铲取，尽可能少带泥土（如专作土壤藻类研究，则应分层采土，进行培养）；生长在树干上的，要用刀削取。生长在石上的，最好用小刀刮取；生长在水生高等植物上的，要用镊子取下生长藻类最多的部分叶、茎一同保存（尽可能记下植物名称）；生长在土壤上的，最好用刀铲取，尽可能少带泥土（如专作土壤藻类研究，则应分层采土，进行培养）；生长在树干上的，要用刀削取。1.着生藻类对于生长在其他物体上较大型藻类，一般用手或镊子采取。应尽可能采取整个植物，包括它们的基部或着生部分。生长在石上的，最好用小刀刮取；生长在水生高等植物上的，要用镊子取下生长藻类最多的部分叶、茎一同保存（尽可能记下植物名称）；生长在土壤上的，最好用刀铲取，尽可能少带泥土（如专作土壤藻类研究，则应分层采土，进行培养）；生长在树干上的，要用刀削取。着生藻类着生藻类漂浮藻类在各种静水水体中，常漂浮一些丝状藻藻丛。采集时应注意取同一藻丛上不同颜色部分或不同颜色的藻丛，特别是变成黄褐色部分常为生殖时期的植物体。如采集较长的、分枝的藻类，不宜折取一段藻体，而应尽可能采整体。2.漂浮藻类3.浮游藻类浮游生物网一般用25号（网孔为0.06毫米）筛绢做成。在湖泊内应用的浮游生物网为圆锥形，口径约20厘米，网长约60厘米准备好采集工具，在水面较宽、较深水体中要用:采水瓶采取垂直分层定量藻样和水样需用采水瓶。

制作时，可用直径约3～4毫米的铜条或粗铅丝作一环，来支持网口，使它成环形。用金属（如铝、钢精或铜）或玻璃小筒，套结在网底，通常称为网头，用来收集过滤到的藻类。由于滤液内有浮游动物，如时间放得较久，往往藻类有不少被浮游动物吞食，所以若不马上观察，需用固定液固定。若用来分离藻种，可用13号筛绢（网孔0.1毫米）再将滤液过滤一次备用。有些地方购买筛绢较困难，也可不用浮游生物网，而用采水瓶，或一般器皿。但因藻类个体较少，最好多采些水样，待沉积后观察。（1）浮游生物网制作及使用取一个500mL（或1000mL）的广口瓶，瓶底附一块重1.5kg的铅块（或不锈钢块），用铅丝固定在瓶底。瓶口橡皮塞穿三个孔，一孔插进水的长玻管，一孔插排气和出水的短玻管，一孔插温度计。进水管与出水管的上端都高出塞面3cm左右，进水管下端接近瓶底，出水管下端接近塞底。用一根长约24cm的软橡皮管，一头紧套在排气管上，不使脱落；另一头则较松地套在进水管上，并在此处扎一根细绳（既要扎牢，又不能影响以后排水）。还要在瓶颈上扎一根较粗的绳子，以沉下或拉起水瓶。（2）采水瓶制作采水瓶使用采样时，将采水瓶沉没到规定水层，向上拉细绳，使橡皮管与进水管脱开，水即可迅速进入采水瓶（为使进水速度快些，玻管内径最好粗些，在10mm以上）。待3～5分钟后，将瓶提出水面，先看水温，再倒出水样。硅藻衣藻蓝藻大型海藻4.各种藻类的采集水绵衣藻分布很广，绝大部分在淡水中。一般生活在有机质丰富的较不流动的水沟、水池或临时水洼中，在流动性的或清洁的水池里较少。南方农民用的粪池或粪缸中（一般在粪不多而上层有较多水的缸），经常有纯粹的衣藻群，致使水呈绿色（有时还有眼虫）。一般衣藻最多的时期是在春末、秋初，气温在10～20℃，在上海、江、浙一带，一年四季几乎都可采到。形成胶鞘体的常在渐趋干竭的水池岸边。如欲得到较多且纯粹的材料，可用大的广口瓶盛入2/3有衣藻的池水带回。瓶的一面用黑纸遮起，另一面承光，放在窗台上。这样，由于衣藻具有趋光性，大量聚集于光亮面，然后用吸管吸取备用。要得到结合生殖时期的衣藻，当气候骤然变化时就可能采到。如在上海，当冬季寒潮到来的次日采集时，就会发现结合状态的衣藻。（1）衣藻在池塘中，缓慢流动的河水中，有时在岸滩边，可发现水绵，特别是春、秋两季更多。生长初期它们是亮绿色，在衰亡和生殖时发黄。水绵用手触之有滑润的感觉（其他有些丝状藻也会有滑润感）。采集标本时，应该在一个水域中选择若干不同地点，对不同颜色的都要采集，且不可看材料已变黄绿不洁，成一种破棉絮状漂浮物时就弃之不采，因为这样就常把生殖状态标本遗漏。在采集时，如要知道材料是否已经是接合时期，除了观察颜色是一种鉴别方法外，也可把盛有材料的容器正向着太阳光，用放大镜在管外看一下。如果丝状体上有褐色斑点则是形成了接合孢子，这样的材料一定要带回。（2）水绵硅藻在自然界中分布很广，大量存在于水体中，在水底各种物体表面上都可以找到它们，经常出现于潮湿岩石表面（呈黄棕色），在土壤里也常能见到。附生硅藻可用解剖刀从附着表面刮下来，采集土表硅藻可带一层土。（3）硅藻大多存在于水体中，尤其当大量发生成“水花”时（一般在高温季节和水体富营养化后易产生）很易捞取观察。另外，在水田、河滩、水沟边土面如呈一片蓝黑色也是蓝藻，在雨后积水潭内也能发现，可连泥一起采集。由于蓝藻体表有粘胶层，常造成手触有粘滑感。与其他藻类不同，蓝藻能耐干旱，甚至在直射阳光下，干燥岩石上也可存在。（4）蓝藻31Your

text对海藻生活习性的观察和标本的采集，一般是在潮间带进行的。潮间带的采集简单，不需特殊设备。潮间带有岩礁、石缝、水峡、砂砾和其他各种各样的环境，所以在这里可找到这个地区的绝大部分种类。Your

text潮间带处于海洋与陆地相联接的地带，是指大潮期间潮水涨得最高的水面和退至最低线之间的地区。一般绿藻主要生长在潮间带，褐藻、红藻多数生长在潮间带和潮下带。（4）大型海藻大型海藻包括褐藻、红藻和绿藻。采集地点的选定：32Your

text海藻一年四季均有生长，但因季节不同，各种藻类的生长和分布亦各有不同。一般说，南方在每年三、四月，而北方在五、六、七月为采集海藻最适宜时期（四、五月是海藻生长最盛、种类最多的时候，六、七月则能采到有繁殖器官的藻体）。Your

text海水每日两次涨潮和退潮（有的地区例外），标本采集工作，最好在退潮时，跟随潮水退落时进行。农历每月初一至初三及十五到十八是大潮期间，潮水退得最低，这时在岩岸及岩池中进行采集标本工作，能采到生活于潮间带的各种海藻。（4）大型海藻采集地点的时间：分离藻种，首先要采集藻种水样。采样个体较大的浮游藻类，可用浮游生物网在水中捞取。通过浮游生物网的过滤，可获得数量很大的藻类样品。采样但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料藻类，一般是个体很小的几微米到十几微米的微型藻类，用浮游生物网无法有效采集。采样因此，需要把含有微型藻类的水样采回，在室内通过超滤、离心等方法进行处理。采样2341

藻种分离意义：

为了要进行某种藻类的科学研究或大量培养，有必要把某种藻类与其他生物分离。因为在培养和生产过程中要受敌害生物的污染，只有分离出”纯种”进行培养，才能获得好效果。藻种分离主要有以下四种。离心法趋向运动法稀释法平板分离法将混合藻液放入离心管中离心，水中不同藻类和微生物都向离心管底部下沉，但下沉的速度不一样，可将藻类分开。把不同时间下沉到管底的藻体取出镜检，选定含所需藻类较多的沉淀物，加培养液再离心，多次反复上述操作，可以获得具有一定纯度的所需藻种，但难以得到单一纯度。1.离心法（1）优点（2）缺点可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。不能做到使不同藻类完全分离。

离心法某些藻类具有趋向性。在用光照射时，就会向光照处集中，这时即可把集中的藻体取出而移入另一容器中。对于有鞭毛的或具游动孢子的种类，如衣藻、盐藻、扁藻等，都可利用此特性来分离藻种。将第一次获得的藻体部分，移入已消毒的培养液中，再反复利用这种方法来分离，结果可得到有一定纯度的藻体。这种分离效果较好，但只能用于运动型微藻。2.趋向运动法

把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。3.稀释法

稀释法用已消毒的试管5根，第一管中装培养液9毫升，第2-5管中各装9毫升，高压蒸汽灭菌冷却后，向第一管中加入1毫升混合藻液，充分震荡，使均匀稀释。用灭过菌的吸管自第一管中吸取）1毫升混合液移入第2管中，震荡使均匀稀释。同法依次移入第3-5管中，并都充分震荡均匀稀释，将5个试管中的藻液分别取1毫升加入5个已灭菌的培养皿中，然后把加热灭过菌冷却而尚未凝固的琼脂培养基加入培养皿，将加了培养基的培养皿顺时针转三次，逆时针转三次，前后摇动两次，使藻液和培养基混匀。待凝固后，将培养皿放在漫射光下培养，一直到出现藻群落为止，一般来说，在20℃左右，约10天即可出现藻群落。此法操作比较简单，容易成功。

稀释法这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。培养过程中每天轻轻摇动1-2次，摇动时避免培养液沾湿棉花塞。经过一段时间培养，藻类生长繁殖数量较多，再经一次显微镜检查，如无其他生物混杂，才达到分离的目的。如还有其他生物混杂，则再分离，直到获得单种培养为止。4.平板法（1）平板培养基制备选择恰当的无机培养液，加入1％琼脂（剪成细条）放在培养液中浸泡加热融化，搅拌，并且补充蒸发掉的水分分装：冷却后分装在培养皿中，约0.3～0.5cm厚灭菌：高压蒸气灭菌，间歇蒸气灭菌（2）喷雾法喷雾法：在无菌条件下用经消毒的培养液把水样稀释到合适的浓度，装入消毒好的医用喉头喷雾器中，打开培养皿盖，把水样喷射到培养基平面上，使水样在培养基平面上形成分布均匀的一薄层水珠。盖上盖，放在合适的培养条件下培养。（3）水样稀释程度水样稀释程度水样喷射的培养基平面上必须相隔1厘米以上才有一个生物（或一个藻细胞），将来生长繁殖成一群体后容易分离取出。稀释不够，将来生成的藻细胞群落距离太近，不容易分离。（4）划线法水样不用稀释，取金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，在液体培养基中冷却，蘸取水样轻轻在培养基上做第一次平行划线3条，转动培养皿约70度，将接种环上剩余物烧掉，通过第一次划线部位做第二次平行划线，用同法再做第三次和第四次划线。主要划线部位不可重叠。由于沾到接种环上细胞较多，在第一次划线部分藻细胞群落密集分离不开，但在第三、四次划线部分，可分离出孤立的藻类群落。选直径5mm的细玻璃管在酒精喷灯上拉成极细的微吸管（口径0.008～0.16mm），将稀释的藻液置于凹玻片上（或将水样在载玻片上滴成绿豆粒大小的一些水滴，这样可使每个水滴中有很少生物而便于分离）在解剖镜下用微吸管吸出所需要的藻种放入另一凹玻片上（用蒸馏水或平衡矿物质溶液冲洗数次），镜检这滴水中是否达到纯的要求如不纯要反复数次，直至达到分离的目的为止，然后移入灭菌的培养液中进行培养（先导入有培养基的小培养皿中培养，待生长旺盛后，再扩大培养）。5.微吸管法此种方法适合于大型藻类和浮游动物。技术操作要求高，细心，吸取一个细胞要反复几次才能成功。用微吸管吸取稀释适度的藻液，滴到消毒过的载玻片上，水滴尽可能小，能在镜下（低倍）看到整个视野的全部水滴或大部分，一个载玻片上放2～4滴，作直线排列，水滴间要有一定的距，如果一滴水内有1至几个所需要的同种藻细胞，并无其它生物混杂，即用微吸管吸取培养液把这滴水冲入装有培养液并经过消毒灭菌的试管或小三角烧瓶中．不成功要反复做此法简便，易操作，适宜分离优势种类6.水滴分离法离心法的原理是离心沉淀。将混合藻液放入离心管中离心，水中不同藻类和微生物都向离心管底部下沉，但下沉的速度不一样，可将藻类分开。离心法分别将不同时间段下沉至管底的藻体取出，通过镜检，可选定含所需藻类较多的沉淀物。离心法添加培养液，再次离心，多次反复以上操作，可获得具有一定纯度的所需藻种。离心法难以获得单一纯种。离心法趋向运动法的原理是借助藻类的趋向性。如某些藻类具有趋光性，在用光照射时，就会向光照处集中，这时即可把集中的藻体取出，移入事先准备好的另一容器中。趋向运动法对于有鞭毛或具游动孢子的种类，如衣藻、盐藻、扁藻等，都可以利用此特性来分离藻种。将第一次获得的藻体部分，移入已消毒的培养液中，再反复利用这种方法分离，结果可得到有一定纯度的藻体。趋向运动法趋向运动法的分离效果较好，但只能用于运动型微藻。趋向运动法用已消毒的试管5根，第一管装培养液9ml，第2~5管装4.5ml，高压蒸汽灭菌冷却后，向第1管中加入1ml混合藻液，充分振荡，使均匀稀释。稀释法用灭菌吸管自第1管中吸取0.5m混合液移入第2管，振荡使均匀稀释。同法依次移入第3~5管，并都充分均匀稀释。稀释法把5个已盛有灭菌琼脂培养基的培养皿，加热使培养基溶解，待尚未凝固时，将5个试管中的藻液各取1ml分别加入5个培养皿中，再用力摇动培养皿，使藻液和培养基混合均匀。待凝固后，将培养皿放在漫射光下培养，直到出现藻群落。稀释法一般来说在20℃左右，约10天即可出现藻群落。如果藻群落仍不纯，可以反复进行若干次。稀释法

藻种保存离心法趋向运动法稀释法平板分离法CBADE单种培养不容易，需要花费很多精力和时间藻种保藏的目的是使藻种能在较长的时间内保存下来。需要时可随时取出使用。有些藻种是选育出来的。一旦藻种分离成功，获得单种培养后，可供实验和生产性培养使用。一、为何要进行藻种保存？继代保存请输入标题请输入标题超低温保存固体培养基保藏液体培养基保藏降温液氮法玻璃化低温保存浓缩低温保存技术冷冻真空干燥保存法

藻种保存保存方法固液双相培养基保藏低温甘油生理盐水法二1.继代保存Your

text

藻种保存继代保存是指把藻种接种在单一固体、液体或固-液双相培养基上,在低温(是指温度控制在5～8℃之间)、弱光(通常指在冰箱内装1支8W的日光灯照明)条件下培养,一代一代传下去以延续“种族”的1种方法,接种1次可保藏半年到1年。2.培养基制备Your

text

藻种保存液体培养基通常用消毒海水按常规配方(例如F/2培养基)配制；固体培养基即平板培养基,作为保藏藻种用的固体培养基,其营养物质的浓度应按常规配方增加1倍,用合适的仪器分装后,加入适量琼脂,培养液经高压蒸汽灭菌后,取出,试管应倾置成斜面,三角烧瓶则平放,冷却后即成固体培养基。

3.接种三角烧瓶和克氏扁瓶可用接种环或喷雾法接种。利用医用喉头喷雾器把藻液均匀喷射在培养基平面上。接种方法在超净工作台中，把试管的包扎纸和棉塞取下，用灭菌的接种环蘸取藻液在培养基斜面上做“之”形划线接种，再把棉塞塞好，贴上标签，绑紧包扎纸。68液体或双相培养基保藏的藻种,接种后可直接放置低温、弱光的条件下保藏,也可在适宜光照条件下培养3～4d后再移置低温、弱光条件下保藏。而仅用固体培养基保藏的藻种,接种后应首先放在适宜的光照条件下培养,待藻细胞生长繁殖达到较高密度,在平板上可见明显的条状或块状的藻细胞群,再移置低温、弱光的条件下保藏。4.培养保存

藻种保存

固液双相保藏固液双相保藏的具体步骤:先将固体培养基灭菌，将灭菌的培养基放置在500C的烘箱中冷却，向冷却后未凝固的培养基中注入适量藻液混匀，待培养基凝固后加入灭菌的液体培养基液封，将培养基放置在弱光、阴凉处保藏，此种保藏方式能保藏1年以上。

三、应用概况固体培养基优缺点YOURTEXT固体培养基保存期较长但容易干涸液体培养基简便易行,但保存期短；由于简便易行,目前在生产和科研实践中,保存藻种最常用的仍是液体培养基。液体培养基优缺点

应用概况注意事项作为目前一般实验室保存藻种的常规方法,继代保存简便易行,设备简单,但工作比较琐碎,耗费时间和精力。在多次的移接过程中,稍有疏忽就会使藻种污染上杂藻、细菌或原生动物,使保种失败,而且还会使藻种逐渐老化。为避免这种情况,每1种藻类的保存,至少要保存3种不同年龄的藻种,最早的藻种用于传代,其余2种以备培养发生意外时急用。

四、超低温保存所谓超低温即指液氮低温(-196℃),以区别于其他低温概念的冰箱温度(4～-40℃)和干冰温度(-79℃)。微藻的超低温保存研究起步较晚,目前普遍采用2步冷冻法,即慢速降温进行冷适应,然后投入液氮中保存。并且,一般进行快速解冻活化复苏效果较好。但由于微藻的种类很多,适宜的保存条件各异,如何因种而异,找出不同微藻的超低温保种方法,应是今后努力研究的目标。

五、超低温保存基本原理在液氮低温-196℃下,生物体的物质代谢和生长活动几乎完全停止,可是它们仍处于可逆的成活状态。通过添加一定的抗冻保护剂,防止细胞在降温冰冻过程中严重脱水和低温休克,避免细胞内冰晶的形成,采用适当的冰冻速度,使细胞安全地越过冰晶形成危险区(从细胞介质或原生质的冰点到-60℃),进入玻璃化状态,以达到长期保存的目的。基本原理玻璃化所谓玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程。玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显变化,水分子停止运动,保持原来的无序状态,形成坚硬、均匀的团块结构。玻璃化的细胞不会出现原生质的严重脱水,细胞结构完整,解冻后即可恢复生长繁殖能力。玻璃化低温保存1、超低温保存方法极大地提高冷却速率增加溶液浓度753、增加溶液浓度保存方法增加溶液浓度沉浸法镜面接触法喷溅法76沉浸法喷溅法镜面接触法将生物样品快速地浸入(或弹入)低温液体中。将低温液体经过喷嘴高速喷溅到生物样品上,或是将生物样品的悬浮液高速喷溅进入低温液体中,以达到样品被快速冷却的目的。将生物样品快速地与某固体镜面接触,而此固体镜面预先被冷却至77K或更低温度。为了达到高的冷却速率,要求固体镜面具有高的导热系数和比热,常用的有铜、银、蓝宝石等。4、玻璃化概念浓缩低温保存法Your

text5.浓缩低温保存技术将藻液高密度培养后,采用物理、化学的方法浓缩1000倍左右，再低温保存。国外自80年代末开始就有对海洋经济微藻的浓缩方法和低温保存方法进行研究,取得了不少的研究成果，其中美国、英国和日本已有相应的产品(微藻浓缩细胞或称“藻膏”)问世。蒋霞敏等将小球藻和球等鞭金藻3011(IsochrysisgalbanaPark)浓缩后，在5℃～7℃的冰箱中保存1～3个月后恢复生长获得好于常温的效果。孙建华、王如才（1993）对小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、球等鞭金藻的浓缩和保存方法进行了研究,浓缩藻液在1℃～4℃的低温下加保护剂SAMs保存3个月,复苏后效果良好。浓缩低温保存多用于海洋微藻。微藻浓缩液的生产,可以使海洋微藻的生产与使用保留一定的时间差。但相对保存时间较短，海洋微藻的抗逆原理还有待作更多的研究和探讨。冷冻真空干燥保存技术Your

text6.冷冻真空干燥保存技术在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使藻种的新陈代谢活动处于高度静止状态。19世纪末Fkral与Mudd创立的冷冻真空干燥法是迄今公认最佳的藻种保存法,严珍等选择脱脂牛奶作为保护剂，将藻液放入安瓿管中，冷冻、干燥并抽真空，火焰熔封。在低温避光处保存，预计最大保存年限为18年。冷冻干燥保存法优点是微藻复苏效果好，保藏期内可避免其他杂菌污染，便于携带运输，易实现商品化生产；其缺点是操作繁琐、对设备要求高等；应用前景十分光明。7、低温甘油生理盐水法低温甘油生理盐水法是对甘油原液保存法的改进。加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，更有利于藻种的保存。在藻液中入一定的甘油作保护剂,同时加入一定的生理盐水,混匀后直接放置在-20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存时间长，一般3年左右。从理论上讲,以上方法均可用于微藻的保存,但由于所需试验系统比较复杂,设备比较昂贵,玻璃化冻存微藻尚处于起步阶段,但它无疑是对微藻超低温保存的1种新的尝试。化学药品消毒法

在生产性大量培养中，大型容器、工具、玻璃钢槽和水泥池消毒一般常用化学药剂消毒。

1、酒精（C2H5OH）

酒精即乙醇，能使生物体蛋白质脱水变性凝固，具有杀菌作用。浓度为70%-75%的酒精杀菌能力最强，常用于小、中型容型的消毒，方法是用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹。容器可在几分钟后，用消毒水冲洗。刚冲洗的容器可用纯酒精消毒。2、高锰酸钾（KMnO4）

高锰酸钾又称为灰锰氧，为紫色针状结晶。易溶于水，是一种强氧化剂，能使蛋白质变性，杀菌能力很强。消毒时按10-20mg/L配成高锰酸溶液，容器、工具浸在溶液中5分钟，取出，用消毒水冲洗2-3次。玻璃钢水槽和水泥池消毒可用0.05%浓度的高锰酸钾溶液由池壁顶部淋洒池壁几遍，并刷洗池底，10分钟后再用水冲洗干净。注意浸泡高锰酸钾的时间不能过长，如果超过1小时，容器、工具上有棕褐色的沉淀，很难洗去。高锰酸钾溶液一般应当天配当天使用。

3、石炭酸（苯酚C6H5OH）

石炭酸主要破坏生物细胞膜，并使蛋白质变性。水毒按3%-5%，的比例配成溶液，把洗刷的容器、工具放在溶液中浸泡半小时，用消毒水冲洗2-3次。4、盐酸（HCl）

取工业用盐酸1份，加淡水9份，配成10%的盐酸溶液。容器、工具放入盐酸溶液中浸泡5分钟，后用消毒水冲洗2次。也可用来消毒水泥池或其他容器。漂白粉白色粉末状物质，是氯与氢氧化钙作用的产物。在空气中因受二氧化碳作用，逐渐放出次氯酸而有强烈的刺激性气味。工业上用的漂白粉一般含有效氯为30%-35%，消毒时按0.01%-0.03%的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时再用消毒水（经过煮沸或沉淀过滤的水）冲洗三四次即可。白瓷砖池、水泥池的消毒可配成高浓度浆糊状的漂白粉溶液淋洒池壁，半小时后用消毒水冲洗干净。为充分消毒培养池，也可用较低量的漂白粉进行全池浸泡后用消毒水冲洗干净。漂白粉有氯臭味，需要停放12小时才能接种使用（一般下午消毒池子，明天早上接种），以免抑制培养单胞藻的生长。漂白精也可用漂白精进行消毒，漂白精主要成分是氯化钠和次氯酸钠，漂白液含有一定量的NaClO，有效氯100g/L（5%）以下，是工业上用电解饱和NaCl溶液的方法来制取NaOH、Cl2和H2，并以它们为原料生产一系列化工产品，称为氯碱工业化工厂的副产物。由于漂白液具有价格低廉、无大型杂质、不产生沉淀物及便于储藏和用法简单等优点，被育苗场广泛地用于容器、工具和培养池的消毒。使用时可参照漂白液的用量进行具体调整。微黄色溶液，有似氯气的气味漂白粉是一种强氧化剂，能使蛋白质变性，杀菌能力强，杀菌的主要成分是氯。漂白粉消毒法常常将洗净的容器、工具等在19%~5%的漂白粉悬浊液中浸泡半小时，再用消毒水冲洗23次。一般来说，消毒效果随浸泡时间增加而增强。漂白粉消毒法用于玻璃钢水槽、水泥池的消毒处理时，操作方法同高锰酸钾溶液消毒法。漂白粉消毒法漂白粉消毒水是比较彻底的方法。生产上常用的具体做法是，用市售的漂白粉（含有效氯约30%）以80~100mg/L处理消毒12~24h，加入硫代硫酸钠60~80mg/L，2h后即可使用。漂白粉消毒法PointA容器与工具的消毒PointB培养用水的消毒消毒物理消毒请输入标题请输入标题煮沸消毒请输入标题请输入标题一、容器与工具的消毒化学消毒加热消毒直接灼烧消毒烘干箱消毒紫外线消毒酒精消毒高锰酸钾消毒盐酸消毒漂白粉消毒为了防止单细胞的污染，培养用的容器和工具都必须经过消毒。消毒和灭菌的定义是有区别的。灭菌是指杀死一切微生物，包括营养体和芽孢.消毒则只杀死营养体，不杀死芽孢。加热消毒法是利用高温杀死微生物的方法。因此，不耐高温的容器、工具如塑料和橡胶制品不能用此法消毒。（一）物理消毒直接在酒精灯火焰上短暂灼烧。简单、方便、快速、效果好，但只适用于小型金属或玻璃工具，如接种环、镊子、小刀、试管口、瓶口等；2.直接灼烧灭菌1.加热消毒2.直接灼烧灭菌接种环、镊子等金属小工具，试管口、瓶口等可以直接在酒精灯火上灼烧灭菌。载玻片、小刀等则最好先蘸酒精，然后再酒精灯火焰上点燃，等器具上的酒精烧光，也就完成了灭菌操作。直接灼烧灭菌可以直接将微生物烧死，灭菌彻底。3.煮沸消毒把小型工具或容器用纱布包好放入锅中，加水煮沸消毒，一般煮沸15分钟～30分钟。大型锥形瓶消毒，可在瓶口上放一只普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一称量瓶盖或表面皿，在锥形瓶内加入少量淡水，置电炉上加热煮沸15～30分钟，可使整个瓶壁消毒，同时冷凝水回滴入锥形瓶。消毒完毕即用牛皮纸或消毒的纱布盖在瓶口。煮沸消毒锅4.烘箱干燥消毒烘箱亦称恒温干燥箱。将玻璃容器、金属工具等用水清洗后，用牛皮纸包扎后放入烘箱，关闭烘箱门，打开箱顶的通气孔，接通电源。当温度上升到120℃时，关闭通气孔，继续加热至温度达到120～170℃，恒温烘烤2小时，然后停止加热，待烘箱温度自然降至60℃以下打开烘箱门取出消毒后的器具。5.紫外线消毒法消毒使用的紫外线是C波紫外线，其波长范围是200－275nm，杀菌作用最强的波段是250－270nm，紫外线消毒的最适宜温度范围是20－40℃，温度过高过低均会影响消毒效果，可适当延长消毒时间，用于空气消毒时，消毒环境的相对湿度低于80％为好，否则应适当延长照射时间。一般紫外线照射20-30分钟，即可起到消毒作用。注意事项：不得使紫外线光源照射到人，以免引起损伤。紫外灯二、化学药品消毒能使生物蛋白质脱水变性凝固。一般用浓度70％的酒精。用于一级培养的中、小型容器的消毒。是一种强氧化剂，使蛋白质变性，杀菌能力很强。10～20ppm，5～10min。用于二、三级容器、工具。酒精（C2H5OH）高锰酸钾（KMnO4）盐酸消毒配置盐酸工业盐酸盐酸取工业用盐酸1份，加淡水9份，配成10%的盐酸溶液。容器工具放入盐酸中浸泡5min，后用消毒水冲洗2次，主要对玻璃培养瓶的消毒。102Your

text漂白粉Ca（ClO）2又称氯石灰，在水中释放氯气和初生氧，有强杀菌作用。成本低，消毒也比较彻底，是生产上二、三级培养池和大型容器、工具常用的消毒方法。

漂白粉消毒Your

text工业用漂白粉一般含有效氯30～35％，消毒时按100～300ppm的有效氯含量配成水溶液，容器、工具浸泡30min以上，消毒水冲洗2～3次即可；培养池消毒，用高浓度浆糊状洒淋池壁，半小时后用消毒水冲洗干净。010203能够达到杀灭敌害生物目的消毒处理后海水必须无毒消毒方法经济、简单、易行培养用水消毒为了防止敌害生物污染，配制培养液的海水必须经过消毒，杀死其中的敌害生物。培养用水常用的消毒方法有过滤、加热、化学消毒剂和紫外线消毒等几种。选用消毒方法应考虑下列三方面的情况：1.加热消毒把经沉淀的或沉淀后再经砂滤的海水于烧瓶或铝锅中煮沸消毒。海水加热消毒，冷却后须经充分搅拌或震荡，使其恢复溶解气体量。通常保种培养用水多用加热消毒法进行消毒。2.过滤除菌法把经沉淀的海水，经砂过滤装置(砂滤池或砂滤罐)过滤，把大型的生物的非生物杂质除去，再经陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物。还有双过滤装置，使海水经过两次过滤，除菌更有保证。砂滤装置，滤水迅速、滤水量大，在微藻的大量培养中使用，能满足大量用水的需要。但是微小生物不能完全隔除，除菌不彻底是砂滤的缺点。为了克服这一缺点，可采用两次砂滤、陶瓷过滤罐过滤或进行水的再消毒处理。沙滤罐陶瓷过滤罐106Your

text1)量取浓盐酸84毫升，加蒸馏水(或用淡水代替)916毫升，配成一个摩尔浓度的盐酸溶液。2)称取氢氧化钠40克，溶解于1000毫升蒸馏水(或用淡水代替)中，配成一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液。

3.酸处理消毒Your

text根据所需处理水量的多少，按每1000毫升海水加一个摩尔浓度的盐酸溶液3毫升的比例，加酸充分搅拌。加酸后海水的PH值可降到3左右(PH值2.9-3.1)。酸处理12小时以上，一般下午开始酸处理到次日上午止。处理完毕，再按每1000毫升海水加入一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液3毫升的比例，加碱中和，使海水的PH值恢复到7.5-8.0左右。然后立即施肥，接种培养。酸碱溶液配制酸处理4.漂白粉或漂白液消毒海水经沉淀及砂过滤装置过滤后流入海水消毒池，使用漂白粉或漂白液消毒。目前生产上最常用的是漂白粉[Ca(ClO)2]和漂白液(NaClO)。漂白粉起消毒作用的成分是其中所含的有效氯。市面上出售的漂白粉，其有效氯含量一般为30%-35%，漂白精的有效氯含量一般为60%-70%，比漂白粉高一倍。这种氯含量极不稳定，易与空气中的二氧化碳化合而不断消失，同时也容易从空气中吸收水分而潮解成半流动体，并很快分解产生次氯酸而散逸。如果产品出厂后经过的时间较长，储藏又不严密，就很容易失去消毒作用。因此在使用时，若不预先测定其有效氯含量，而仅以出厂时标明的氯含量来计算漂白粉使用量，往往达不到预期效果。消毒时，直接向水中加入漂白粉或漂白液，使有效氯含量达到25×10-6左右，停放6-7小时，可将水中的细菌、杂藻、原生动物等杀死。使用前，需要用硫代硫酸钠(Na2S2O3)进行中和。在生产上用硫酸——碘化钾——淀粉试剂作为指示剂，先计算出理论上所需硫代硫酸钠的量，将此数据作为参考，逐渐往里加，边加边搅动，加到一大半时，用指示剂测定，若变成蓝色，则说明还有余氯需要继续中和;当滴加指示剂无兰色出现时，说明中和彻底。有些生产单位用碘化钾溶液作为指示剂，若溶液变黄，则说明还有余氯需要中和，这种方法虽然在理论上成立，但容易在视觉上产生误差，造成水的中和不彻底，影响微藻的培养效果，不应提倡。使用方法漂白粉使用量关于消毒海水时漂白粉或漂白液的用量，可根据实际情况确定。用25×10-6有效氯的漂白粉或漂白液消毒海水，可以杀死大部分敌害生物，但对危害严重的大型变形虫无法杀灭。用100×10-6有效氯的高浓度漂白粉或漂白液消毒，可以杀死包括大型变形虫在内的一切敌害生物。敌害生物的出现具有季节性，一般以6-9月份为敌害生物危害严重季节，可以在些季节内用较高浓度的漂白粉或漂白液消毒海水。而在冬季和初春(敌害生物较少出现)，可用较低浓度的漂白粉或漂白液消毒，力求降低生产成本。漂白粉消毒海水(或淡水)是生产上最常用的方法，成本较低，消毒也比较彻底。紫外线消毒水的原理，系海水经一定量煞费苦心的照射产生臭氧，而臭氧产生的原子态氧具有较强的氧化作用，从而杀死海水中的部分微生物和某些藻类。这种消毒方法经济、残余的有害物质少。但设备较为昂贵，水流量不易控制，须有专人看管;否则，易烧坏紫外线灯管。有条件的单位可以考虑使用。砂滤海水以一定的流速经过紫外线消毒器，即可完成海水的消毒;或向消毒池海水充以经紫外线照射的空气，也可实现海水的消毒。加热消毒法加热消毒法是利用高湿使蛋白质变性以杀死微生物的方法。不能时高温的容器和工具，如塑料、橡胶制品等不能用此法消毒。加热消毒法加热消毒法加热消毒法0102直接灼烧灭菌03煮沸消毒烘箱燥消毒加热消毒法直接灼烧灭菌接种坏、镊子等金属小工具，试管口、流口等可以直接在酒精灯火焰上短暂灼烧灭菌。加热消毒法加热消毒法煮沸消毒把小型容器和工具用纱包好，放入钠中，加水煮沸消每，一般约煮沸1530min，可杀死细菌的营养体。加热消毒法加热消毒法烘箱燥消毒此方法是实验室中常川的干热灭菌法。将清洗过的玻璃容器、金属工具等用报纸或牛皮纸包好，均匀地放入烘箱：般加热至120-170℃维持2h即可达到目的。加热消毒法加热消毒法实验三单细胞培养容器、器具、用水消毒一、【实验目的】学习并掌握培养单细胞藻的容器工具及用水的消毒方法,为今后成功培养单细胞藻打基础。二、【实验原理和基础知识】单细胞藻培养用的工具、容器及水都必须经过严格消毒,尽可能杀死一切生物,以免污染影响藻类生长和繁殖。。三、实验用品：1、实验器材仪器设备:恒温干燥箱、电炉、电子天平、充气泵工具容器:250ml三角烧瓶(每人2只)400ml烧杯30只3000ml三角烧瓶10只(6人/组)搅拌棒20根移液管(5或10ml)30支塑料桶4个移液管(1ml)30支乳胶管若干容量瓶(100ml)30只量筒100ml30只2、药品浓硫酸、重铬酸钾、漂白水或次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠。洗液的配制方法:称15g重铬酸钾至干燥的烧杯中,然后加入200ml粗硫酸,搅拌并加热至重铬酸钾溶解,即得洗液,冷却后将上清液倒入试剂瓶中备用。3、实验材料海水200L、淀粉碘化钾试纸2包、充气管、充气石10粒。四、实验操作步骤3.煮沸消毒小型的容器、工具可放入锅中,加水煮沸消毒15-30min,可杀死细菌的营养体,如果在水中加入2%Na2c03可促使芽孢死亡。较大的三角烧瓶,可在瓶内加少量淡水,套上纸或放一只普通的玻璃漏斗,煮沸消毒15-30min,可使整个瓶壁消毒。然后倒出淡水,盖上消毒的牛皮纸。、外壁。一、工具、容器消毒方法1.洗液消毒法所有待用三角瓶、烧杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自来水(加去污粉)冲刷干净,然后倒入少许洗液,沿着内壁慢慢转动器皿,使其全部浸泡,放置10min后,将底部洗液回收(以备后用),然后用自来水冲净瓶子,把瓶口朝下晾干。移液管应用洗耳球吸取洗液,使其浸泡内壁,10min后,用自来水冲净内2.烘箱干热消毒法将洗净、凉干的玻璃器皿(移液管、金属工具等应用报纸或牛皮纸包扎好),扎瓶口用的纸,棉塞均放入烘箱。打开通气孔,接通电源,加热,待温度上升120℃时关闭通气孔(在升温过程中,如果绿灯熄灭,红灯亮,表示箱内停止加热),恒温2h后,断电停止加热,然后待温度自然冷却至60℃以下,才能打开烘箱门取出容器、工具(实验室保种通常并用洗液消毒法和加热消毒法)。3.漂白水消毒法每人取2L过滤海水加入漂白水(含有效氯10%)0.5ml,搅拌均匀后盖上以防氯气逸出。静止放置16-24h时消毒后再加入等量硫代硫酸钠中和,充气2h,然后用淀粉碘化钾试纸测试是否有余氯(单胞藻二级培养、三级培养常用)。试纸无变蓝表明无余氯存在,即可使用。培养用水的消毒方法1.脱脂棉过滤法取一桶海水置于高处,接好过滤装置、然后控制夹子,慢慢滴水过滤2L.2.加热煮沸消毒法将经脱脂棉过滤的海水,放至电炉烧开,冷却至室温(实验室保种通常并用脱脂棉过滤和加热煮沸法)。1.用加热法消毒培养用水时,三角瓶内的水量不能超过瓶子的2/3,瓶外面不能有水珠,瓶口用纸盖住,不要绑紧。2.洗液在瓶子内转动时,注意瓶口不能对着自己,也不能对着他人。3.干热灭菌过程中,实验者不能离开,严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。4.烘箱内的温度需冷却至60℃以下,才能打开烘箱门取出工具、容器。1.培养单细胞藻的工具、容器的消毒有哪几种方法?2.单细胞藻培养用水的消毒有哪几种方法?3.单细胞藻藻种应如何保藏?注意事项作业与思考作为保藏藻种用的固体培养基的营养物质浓度应按配方增加1倍。制备固体培养基保种用的容器有试管、三角烧瓶、克氏扁瓶等，以15ml试管和250ml三角烧瓶最常用。试管的培养基分装量约为试管长度的1/5，三角烧瓶和克氏扁瓶的培养基分装厚度为0.5~0.8cm。制备固体培养基分装时应避免培养基沾在管口或瓶口上，分装后须塞上棉花塞，再用纸包扎。制备固体培养基培养基经高压蒸汽灭菌后，取出，试管斜置以形成斜面，三角烧瓶和克氏扁瓶则平放，自然冷却，即成固体培养基。制备固体培养基培养液制备3培养液成分

营养元素的浓度培养液配方培养液配制配制培养液是根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在消毒水中按配方加入各种营养物质。214（1）特异性（2）共性不同的单胞藻，对营养元素的需求有所不同，同时，不同的营养元素及不同的营养盐的种类对不同的单胞藻所起的作用也有所差别。各种藻类对营养的需要有很多共同点。一些培养液的配方，能应用于多种藻类的培养。

1.培养液的成分123456不是所有单胞藻培养液都必须具备这七类成分，其中最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和辅助生长有机物质，其他成分只在某些培养液配方中使用其中的一类或两类。培养液主要成分大量元素微量元素辅助生长有机物质土壤抽出液络合剂植物生长调节剂缓冲剂7必需元素必需元素是单胞藻在生长发育过程中不可缺少的元素。按其存在于植物体内的数量多寡分为大量元素和微量元素。二者具有同等的重要性，而且不能相互替代，对于植物的生长和发育都各有其一定的功能，各元素之间也存在着一些作用。微量元素在培养液中所需量很小，但又不能没有。碳、氢、氧3种可从水、空气中取得，氮、磷、铁3种要从水中或土壤中的若干化合物中取得，来源不及前3种丰富，人工培养时必须补充。在人工培养中，需补充的大量元素主要是氮、磷、铁、硅

4种元素。在大量元素中，其中最重要、需要量较大的有碳、氢、氧、氮、磷、铁等6种。素大量元素也叫主要营养元素或主要元素。大量元硅源及其效用040102大量元素来源用效用氮源及其效用铁源及其效用03磷源及其效用

05其他元素氮是植物蛋白质的主要组成成分，对植物的生长发育具有重要的意义。氮源是否充足对微藻的培养至关重要。生产上常用的氮源：硝酸钾（KNO3）硝酸钠（NaNO3）硝酸铵（NH4NO3）硝酸钙[Ca（NO3）2]尿素[（NH2）2CO]氯化铵（NH4Cl）硫酸铵[（NH4）2SO4]发酵人尿氮源及其效用单胞藻对氮元素的利用（1）氮元素的存在形式无机态氮：硝酸态氮（NO3--N、NO2--N）铵氮（NH4+-N、NH3-N）有机态氮：尿素有效氮：能被藻类利用的无机态或有机态氮。（2）氮的转化①氨化作用：含氮有机物转化为游离态氮②硝化作用：铵氮转化为硝酸态氮；③脱氮作用：缺氧情况下，硝酸态氮转化为NO2或N2。单胞藻对氮的吸收方式不同的藻类对硝酸态氮和铵氮的吸收利用情况不同。大多数单胞藻能吸收无机态氮，但对硝酸态氮和铵氮吸收的速度和利用的情况有差异，优先吸收铵氮（吸收完后再吸收NO3—N）。少数藻类（如小球藻等）能吸收有机态氮。硝酸态氮培养单胞藻较好。培养小球藻，尿素的效果比硝酸盐好。生产中，一般一级培养多用硝酸钾和硝酸钠，二三级培养多用尿素。应尽量避免使用会导致藻液中铵氮上升的氮源。硝酸态氮缺点①往往会引起脱氮作用（NO3

缺ON2）。②有铵氮存在时，会影响吸收。铵氮缺点①具毒害作用。特别是对养殖对象的毒害远超硝酸态氮，当其在水中浓度超过0.025ppm就对鱼类有毒害作用；②微量铵氮存在，会影响硝酸态氮和有机态氮的吸收，造成这些氮的浪费；③铵氮优先吸收，但吸收后的生长率并不比硝酸态氮和有机态氮好。尿素缺点①对某些藻类有毒害作用；②后吸收；③有NH3-N存在时，尿素效用大大减弱；

硝酸态氮、铵氮和尿素缺点磷源及其效用磷是组成核酸、能量转换物质、脂类物质和维生素等不可缺少的元素之一，对植物的生命活动有重要意义。生产中常用磷源：磷酸二氢钾（KH2PO4）磷酸氢二钠（Na2HPO4）（其次）磷酸二氢钠（NaH2PO4）磷酸氢二钾（K2HPO4）过磷酸钙重过磷酸钙磷酸铵（商品名：安福粉）溶解磷：不溶解磷：活性磷：非活性磷：能通过某种固定超滤膜过滤的磷不能通过某种固定超滤膜过滤的磷

能被钼兰法测定出来的磷不能被钼兰法测定出来磷单胞藻对磷元素的利用铁源及其效用铁是植物体内许多氧化酶所必需的一种元素，且有促进叶绿素作用。常用铁源：三氯化铁（FeCl3）硫酸亚铁（FeSO4）硫酸高铁[Fe2（SO4）3]氧化铁（FeO）柠檬酸铁（FeC6H5O7）柠檬酸铁铵[（Fe（NH4）3（C6H5O7）]铁元素存在形式往往是不溶态的铁，在水中容易形成一种胶体复合物，不能为生物利用，同时容易与其他离子结合形成沉淀。

单胞藻对铁元素的利用可溶性，易为藻类细胞利用。无机态铁有机态铁微藻对铁的需要量很小，但要满足这种需要却比其他营养元素更为困难。加某种有机酸或其盐类以形成可溶性铁化合物。常用有苹果酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸等。加土壤抽出液。因腐殖酸的作用可阻止铁的沉淀和溶胶化。加络合物防止铁和微量元素发生沉淀。常用EDTA-Na2（乙二胺四乙酸钠盐）无机态铁改善利用聚缩磷酸盐反应。使不溶态铁转化为溶态铁。使用有机态铁代替无机态铁。硅源及其利用单胞藻中，特别是硅藻，不但细胞壁（硅酸占96.5％）需要大量的硅酸来形成，在整个生长发育中（尤其在分裂时）都需要硅，而且不能由其它元素来代替。常用硅源：硅酸钠（Na2SiO3）硅酸钾（K2SiO3）偏硅酸钠（NaSiO3·9H2O）更高度聚合形式的硅化合物不能为硅藻所利用。其它元素钾、钙、镁、硫的来源与效用钾在生物体内的主要作用不是结构功能，而是代谢功能。它能使原生质胶体保持一定程度的膨胀，且对光合作用、碳水化合物和蛋白质的合成有一定促进作用；钙能调节原生质的活动和植物体内的酸碱反应；镁是叶绿素的主要组成物质，同时又常与磷酸结合，对植物的生命活动过程起调节作用；硫是蛋白质的重要组成成分之一。钾、钙、镁、硫元素在培养液中一般不需要单独加入。原因：（1）海水中的自然含量比较丰富，一般能满足要求。（2）在加入其他营养盐的同时，附带加入了该元素。如加入KNO3在补充了氮元素的同时也补充了钾元素。常用钾源：氯化钾（KCI）、硝酸钾（KNO3）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4

）常用钙源：氯化钙（CaCI2）、硝酸钙[Ca（NO3）2]常用镁源：硫酸镁（MgSO4）、氯化镁（MgCI2）常用硫源：硫酸铵、硫酸铁、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰等。微量元素常用微量元素化合物（P59）硼（B）：硼酸（H3BO3）硼砂（Na2B4O7·10H2O）（焦性硼酸钠）锰（Mn）：硫酸锰（MnSO4）、氯化锰（MnCl2）、氧化锰（MnO）锌（Zn）：硫酸锌（ZnSO4）、氯化锌（ZnCl2）铜（Cu）：硫酸铜（CuSO4）、氯化铜（CuCl2）钼（Mo）：钼华（MoO3）钼酸铵[（NH4）2O·7MoO3]常用微量元素化合物钴（Co）：氯化钴（CoCl2）钛（Ti）：氯化钛（TiCl2）钨（W）：钨酸钠（Na2WO4）铬（Cr）：硫酸铬钾[CrK(SO4)2]、铬酸钾（K2CrO4）镍（Ni）：硫酸镍（NiSO4）钒（V）：钒酸钠（NaVO3）、钒酸铵（NH4VO3）镉（Cd）：氯化镉（CdCl2）锶（Sr）：硫酸锶（SrSO4）辅助生长有机物质辅助生长有机物质：培养液中对单胞藻的生长有辅助促进作用的有机物质。目前常用的有4类：（1）维生素类：维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素H、生物素、烟酸、叶酸等。其中对单胞藻类影响较显著的是B族维生素，尤其对等鞭金藻的培养非常重要。（2）抗生素类：链霉素、红霉素、土霉素、金霉素等。抗生素对单胞藻生长有促进和抑制两方面的作用，目前对它的研究较弱，生产上尚未大量使用。（3）生长素和生长物质类：萘乙酸、吲哚乙酸、赤霉素、秋水仙素、核酸等。（4）其他：葡萄糖、有机酸盐、肝抽出物、酵母抽出物、贝肉汤、鱼粉、咸鱼汁、氨基酸等。

土壤抽出液

土壤抽出液除含有无机微量元素外，还含有某些单胞藻类需要的辅助生长有机物质（腐殖酸及其盐类）。培养液中加入适量的土壤抽出液，一般能获得良好效果，尤其是对一些较难培养的种类，常能获得培养成功。土壤抽出液因处理过程不同，其营养的成分和数量变化较大。（1）取用土壤或海泥时，必须固定地方，不要经常更换。（2）对培养效果和使用量，均应通过培养试验来掌握了解。土壤抽出液的制作土壤1千克加1升纯水，煮沸60分钟，暗处放置两天后过滤，取滤液500毫升加纯水400毫升使用。土壤1千克加纯水1升，再加入NaOH2～3克，煮沸120分钟，冷却过滤后使用。土壤抽取液I

土壤抽取液Ⅱ土壤抽出液的制作土壤1千克加纯水2升，煮沸煎浓，次日取上清液再煮沸煎浓，第三天如法炮制，直到得到1000毫升深褐色土壤抽取液。取海滩上砂质较少，有机质较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小石块等杂物，以容量计算一份海泥加海水或淡水2份，静置1～2分钟，弃去底部粗砂、小石块等杂物，按每1000毫升泥浆加入1克氢氧化钠的量加入氢氧化钠，煮沸20—30分钟，静置24小时取上清液使用。土壤抽取液Ⅲ

海泥抽取液络合剂络合剂的主要作用是使之与无机态铁等微量金属离子结合形成络离子，以防产生沉淀。络合离子能根据质量作用定律不断释放出金属离子为微藻所吸收利用。最常用的络合剂有：乙二胺四乙酸（EDTA）或其钠盐（EDTA-2Na）

植物生长调节剂

植物生长调节剂：又称植物生长激素，有促进藻类细胞生长繁殖的作用。营养元素的浓度单胞藻培养液中营养元素的浓度依单胞藻的种类、培养目的、培养方式、培养条件等情况的不同而各不相同。但在一个大体范围内又具有许多共同点。生产上主要施加氮、磷、铁、硅四种元素，一般根据不同的情况选用低量、中量、高量三种不同的浓度。氮、磷、铁、硅的浓度单位：ppm元素低量中量高量氮5-1515-30＞80KNO33-50100-200400-500磷0.1-11-4＞4K2HPO41-510-20200铁0.02-0.040.05-0.1＞0.3FeCl30.10.2-0.30.8-1硅2-1520-70Na2SiO310-50根据元素浓度，通过分子量换算出化合物的浓度培养液的配方一些培养液配方是较普遍适用的，有一些是针对某一种或几种单胞藻而定的。有些配方只要加入几种特需的营养元素就可适用不同的单胞藻类。生产中培养液的配方，常以这些配方为基础，再结合实际情况不断进行调整。一般控制主要元素浓度之间的比例为：N：P：S：Fe=10：1：1：0.1培养液的配制母液：为减少每次称量的麻烦，根据配方配成的浓营养溶液。母液是培养液的浓缩。通常在配制培养液时以每1000mL水中加入母液1mL为宜(1:1000)。如配方中KNO3

用量为100g/L，母液每毫升就应含KNO30.1g。贮液：固体营养元素为减少每次称量的麻烦和使用方便而配成的重量百分比溶液。如配1％KNO3

贮液，100ml水加1gKNO3

。贮液可以是单项营养元素配成，也可以是两种或多种营养元素同配而成，但要尽量防止沉淀。培养液的配制用水培养液的配制有用纯水（无离子水或蒸馏水）和天然淡、海水配制两种方法。用纯水配制的培养液，营养元素种类必须齐全，使用的化合物较多，主要用于科学研究或保种，而一般的实验室培养和生产性培养都使用天然淡、海水配制。天然淡、海水是水生生物长期适应于其中生活的优良环境，已存在着植物需要的各种营养物质，因此在配制时只需增加某些在培养中可能引起缺乏的营养元素就成。在生产性大量培养中往往只加入最主要的几种营养元素，且不要求使用纯度较高的化学试剂，可使用工业纯和农肥。培养液配制中的注意事项1、保种用的营养盐应用试剂级（A·R或C·P）。一般生产性培养只需选用纯和工业纯。药品试剂规格保证试剂：G.R分析纯：A.R化学纯：C.P纯：药典规格工业纯：杂质较多2、营养元素的加入要有一定的顺序，一般先加N，再加P，后加Fe。同时，Fe应在EDTA之后加。3、维生素溶液的配制要将各种维生素分别溶解后再混合。若培养用水是加热消毒，一定要待冷却后才能加入。4、每加入一种营养元素，要搅拌均匀后再加入第二种。培养基的组成因光合细菌的种类而异，但主要包括：培养基配置

水分

氮源（无机氮和有机氮）

碳源（有机化合物和碳氢化合物）其次，需加入一定量的微量元素：培养基配置

铜、钾、镁、硫、磷、氯等

以无机盐形式添加

有些还需添加生长因子

（B族维生素和某些氨基酸或核酸）为了保证细菌正常生长，培养基还应维持适当的pH。培养基配置一般细菌在中性至微碱的培养基中生长良好，但也有的在酸性或碱性培养基中生长得更好。由于有些培养基经高压灭菌后pH还会发生变化（降低），所以在灭菌前用1mol/L的NaOH或HCl调节pH，或在培养基中加入磷酸缓冲液以稳定pH。培养基配置3生长在静水或水流缓慢河流中的藻类在迅速流动水中生长的藻在水生生物培养槽中培养藻类21一、藻类粗放培养、保存生长在静水或水流缓慢河流中的藻类，培养比较容易。取到实验室后，要立刻从材料瓶中移到宽大的水生生物培养槽内。为了培养大的丝状藻，要利用宽的、不高的容器。这些容器要用玻片盖住，以防止培养物受灰尘沾污。倒入容器的水要达到容器高度的一半，或稍多些，使水面上还有充分空气。在容器边缘，要用一小块纵切橡皮管垫住，可使玻片不致紧贴容器，空气才能进入容器中。细微的藻类如团藻目、硅藻门能很好地生活于培养皿中。很多藻类如颤藻属、水绵属的若干种、轮藻属等可在实验室中保存很多年。1.在静水中2.在迅速流动水中01在迅速流动水中生长的藻如丝藻属、毛枝藻属等比较难于培养，因为它们要求经常输入氧气。在水层较高水中，在高容器中，这些藻类迅速地死亡。02为了把这些藻类保存到实验时，应当把它们分成一些小部分，放在水层较薄的、宽的容器内，并须常常换水，把空气吹入水中。还可以用橡皮管把水生生物培养槽和水龙头连结起来，建立有流水的水生生物培养槽。在水生生物培养槽中培养藻类时，应尽可能创造和保持藻类天然生存条件。把藻类培养在从采集藻类那一水域取来的水中，或其他天然水（尤其不能用自来水，因其中含很多氯气，必要的话，也须置较长时间，或加以煮开），或在水中加入混合养料，这些养料是由制造有机物质所必需的矿质盐构成。3.培养槽中培养藻类二.预备培养液用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。土壤抽出液制作方法：先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）。再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天。由于气泡上升，棉塞可能弄脏。因此，最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌。3.土壤抽出液制作实验四单细胞培养液一母液的配制单细胞藻大量生长繁殖,必须从环境中吸收各种营养元素,包括氮、磷、铁和微量元素等单细胞藻在不同配方的培养液中生长效果不同,因此要根据各种单细胞藻的生理需求选择合适的培养液把营养元素根据培养液配方进行髙浓度配合(而且稀释液用蒸馏水或去离子水),一般浓缩1000倍,配成母液。目的是培养方便,母液不能直接用于培养单细胞藻类,必须稀释后才用。一般每升消毒海水或淡水中加入1m母液,即为培养液一、实验目的掌握培养液配制的原理、一般方法和步骤,为今后成功培养单细胞藻打基础。二、实验原理和基础知识三、实验用品：1、实验器材电子天平、电炉、容量瓶、烧杯、搅拌棒、试剂瓶、100m量筒、吸管l0ml移液管、耳球、微量注射器2、药品NaNO3、(NH2)2CO、KH2PO4、FeSO47H2O、MnSOEDTA-Na2、ⅤB1、VB12、Na2SiO3、实验材料

蒸馏水四、实验操作步骤1.“宁波大学3号”培养液配方(母液)NaNo3:100gFeso4.7H2O：2.5gKH2PO4

：10gMnSO4：0.25gEDTA-Na2：20g VB1：60mgVB12：50ug蒸馏水1000ml◆培养海水绿藻类、金藻类、硅藻类等使用。在培养硅藻时在此基础上加入0.02g/LNa2sio3,培养螺旋藻时应加29/L的NaHco3。配制步骤(2)压紧容量瓶盖,将容量瓶上下颠倒n次,使其混合均匀,倒进经消毒的试剂瓶内,并贴上标签(母液名称、配制人、日期)。（1）称量和溶解配制母液100ml。按配方先称取NaNo3放入干净的烧杯中,加入约60ml蒸馏水,搅拌使NaNo3完全溶化。然后再依次称取其他各成分,逐一溶解,最后一起倒入100ml容量瓶,再用蒸馏水冲洗烧杯2-3次,并转移到容量瓶中,最后用蒸馏水加至刻度。(在本配方中FeSO4、Mnso4应与EDTA-Na2一起加热溶解)（3）配制0.5%Na2Sio3称05gNa2Sio3置于干净的烧杯中,加入约60ml蒸馏水,搅拌溶解,倒进100ml容量瓶,用蒸馏水冲洗烧杯2-3次并转移至容量瓶中,定容100ml。上下颠倒容量瓶n次使其混合均匀,倒进经消毒的试剂瓶内,并贴上标签(贮液名称、浓度、配制人、日期)配制母液应注意事项1各种营养盐应逐一称量、逐一溶解,倒进容量瓶定容,然后再倒入试剂瓶保存。2.稀释液必须加蒸馏水或去离子水3.难溶解的物质必须与EDTA-Na2一起络合加热溶解4待温度冷却至低于60℃时,才能加入维生素,以免失效。5注意加入烧杯中溶化营养盐的水量应少于所需要定容的水【作业与思考】1.单细胞藻类培养液配制的操作过程中应注意什么问题?2.单细胞藻类的全培养液配方应包含哪些成分?3.试述该配方中的N、P比是多少?根据具体要求，培养基需配制成固体、半固体、液体状。培养基配置配制固体培养基时是在相同成分的液体培养基中加入1.5%~2.0%的琼脂培养基配置半固体培养基是在液体培养基中加入0.3%~0.6%的琼脂。培养基配置接种3藻种质量藻种数量接种时间藻类接种，就是将选好的藻种添加到新配好的培养液中。成功接种的关键是把握好：21一、藻种质量藻种质量，对培养效果影响很大，一般要求选取生活力强，生长旺盛的藻种。常用判别藻种的质量主要从外观和镜检二个方面考虑。看颜色看水中分布看附壁沉淀镜检判断藻种质量水中分布情况，有运动能力的种类上浮活泼运动；无运动能力的种类均匀悬浮于水中看附壁和沉淀情况，好的藻种无明显附壁，无大量沉淀。看颜色是否正常，正常情况下，绿藻类呈鲜绿色，硅藻类呈黄褐色，金藻类呈金褐色好的藻种细胞颜色鲜艳，运动种类运动活泼，无杂藻和敌害生物存在。

藻种藻液的细胞数量应达到收获的浓度或接近收获的浓度。常用培养种要求达到的藻种密度：亚心形扁藻：30～40万个细胞/ml以上三角褐指藻：300万个细胞/ml以上球等鞭金藻：250万个细胞/ml以上二、接种数量1.接种藻液的浓度一、是藻种处于指数生长期，生长繁殖旺盛二、是利用藻细胞分泌的较大量的胞外产物对污染生物进行抑制

2.接种比例接种比例为藻种藻液量与培养液量的比例。接种比例大，可使培养液中的藻类一开始就占优势，有两方面作用：一是可对其他可能污染的生物起抑制作用；二是可缩短培养周期。在环境因子不很适宜，藻类生长不良，敌害生物大量出现的可能性较大时，高比例的接种量尢为重要。保种培