铜绿假单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

铜绿假单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

铜绿假单胞菌（pseudykorriza）是一种非发酵糖皮质激素的阴性菌。这是医院感染的主要病原体之一。碳青霉烯类抗生素通常用作多药耐药铜绿假单胞菌感染治疗的最后手段。然而,医院内铜绿假单胞菌感染治疗广泛应用碳青霉烯类抗生素导致该菌对多种碳青霉烯类抗生素耐药的出现。近年耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌分离株日益增多,并且出现了产金属β内酰胺酶(metallo-betalactamases,MBL)的铜绿假单胞菌。到目前为止,国内外均在铜绿假单胞菌中检测到了MBL,但湖南地区尚未见对铜绿假单胞菌携带金属酶基因的研究报道。本院革兰阴性菌中铜绿假单胞菌所占比率一直处于首位材料和方法一、金属酶表型初筛试验200株铜绿假单胞菌分离自我院2010年11月—2011年4月临床各科室送检标本,分别分离自:痰液及支气管分泌物142株,脓液、分泌液、引流液或穿刺液34株,尿液8株,血液6株,粪便5株,胆汁3株,导管尖端2株,同一患者同一部位分离相同菌株不重复计入。铜绿假单胞菌ATCC27853作为金属酶表型初筛试验质控菌株;产IMP-1的铜绿假单胞菌为阳性对照,由上海复旦大学附属华山医院惠赠。二、仪器、试剂和仪器VITEK-2全自动微生物鉴定与药敏试验分析仪(法国生物梅里埃公司),ABI2720基因扩增仪(美国ABI公司),3730XL测序仪(美国ABI公司),亚胺培南(10μg/片,英国OXOID公司);EDTA(0.5mol/L,pH8.0,4μL/片,自制);2×TaqPCRMasterMix体系(美国Omega公司);D2000(北京天根生化科技公司);IMP,VIM,NDM,SPM及IntI1上下游引物(上海生工生物工程公司)。三、确定细菌和药物过敏试验所有菌株均经VITEK-2全自动微生物鉴定与药敏试验分析系统(法国生物梅里埃公司)进行鉴定及药敏试验。四、生物药敏试验胶片与空白纸片的比例按标准纸片扩散法药敏试验操作规程,用0.5麦氏单位的待检菌涂布MH平皿,然后分别贴IPM药敏试验纸片和一空白纸片,两者相距10mm(边缘距边缘),在空白纸片上滴加0.5mol/LEDTA4μL。35℃孵育18~24h,若IPM纸片靠近EDTA纸片一侧出现抑菌效果增强或出现“匙孔”现象,判定受试菌产金属酶五、综合子基因检测：ml基因(一)总dna和优质粒dna的提取细菌总DNA采用煮沸法提取,质粒DNA采用PlasmidMiniKit(Omega,USA)提取,-20℃保存备用。(二)pcr检测machi基因和i类融合子基因以总DNA和质粒DNA为模板分别进行IMP、VIM、SPM、NDM型MBLs基因及Ⅰ类整合子基因的PCR扩增,各引物序列根据文献(三)基因混合试验以质粒DNA为模板,MBL基因PCR扩增阳性的产物送武汉华大基因有限公司测序,测序结果在GenBank网上进行Blast比对。一、西医融合科5.5%,19.20,常见并发症,6.200株菌株主要分离自ICU27.5%(55/200),神经外科11.5%(23/200),中西医结合科9.5%(19/200),骨科7.0%(14/200),康复科5.5%(11/200)和呼吸科5.0%(10/200),其他各科室(如儿科、普外科、感染科、急诊综合病房、肿瘤放疗科等)34.0%(68/200)。二、结果表明，抗癫痫药物的敏感性试验200株铜绿假单胞菌中,对美罗培南的耐药率最低(8.5%),对庆大霉素耐药率最高(38.5%),见表2。三、试验结果为ml表1200株铜绿假单胞菌中有6株为MBL阳性菌株,194株为MBL阴性菌株,其MBL检出率为3.0%。四、pcr扩增金属酶及整合酶基因以总DNA及质粒DNA为模板分别对6株MBL表型初筛阳性菌株进行金属酶及整合酶基因扩增,扩增出IMP型阳性2株,未扩增出VIM、SPM和NDM阳性株(图2);6株MBL表型阳性的铜绿假单胞菌均为Ⅰ类整合子扩增阳性(图3)。五、imp阳性铜绿假单胞菌感染患者临床资料的初筛结果将2株MBL基因测序结果与GenBank中已知序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov),2株均为IMP-1型。MBL是一类能广泛水解β内酰胺类抗生素的碳青霉烯酶,产该类酶的细菌对所有β内酰胺类抗生素均耐药,给临床抗感染治疗造成极大困难。本院ICU铜绿假单胞菌的分离率仍居首位,主要分离自下呼吸道标本,如痰、支气管分泌物等,该分布趋势与李文波等MBL表型初筛试验显示,6株铜绿假单胞菌MBL表型初筛阳性,阳性率3.0%(6/200),与2005年本院对铜绿假单胞菌产MBL情况调查结果基本一致本研究中IMP阳性铜绿假单胞菌感染的2例患者年龄分别为51岁和78岁,其中1例患者入院前有基础疾病(该例为高血压3级),住院时间均在1个月以上,最长者达103d,且均住在各科室的ICU。2例IMP-1型铜绿假单胞菌感染患者中1例曾有心脏起搏器植入病史,反复长期使用头孢孟多、头孢哌酮-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、磷霉素和万古霉素;另1例患者因全身多处挤压伤、急性肾衰竭和腰椎损伤入院,无基础疾病,入院后并发肺部感染,创面分泌物培养出铜绿假单胞菌,临床采用头孢哌酮-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦和替考拉宁、去甲万古霉素交替进行抗感染治疗。由此可见,病情较重、有基础性疾病、住院时间长、长期使用广谱抗菌药物是产MBL铜绿假单胞菌感染的危险因素,监测和预防产MBL铜绿假单胞菌,尤其是针对危重患者,应列为医院及相关实验室的工作重点。整合子是具有识别并捕获外源基因并使之转