耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的分离鉴定

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的分离鉴定

随着碳绿霉素的大量使用和不合理的使用，以及碳绿霉素类抗生素的肺炎克雷伯菌（crkp）逐渐增加，给临床抗感染治疗带来了困难。crkp感染已成为医院死亡的独立风险因素，近年来国内外抗感染研究热点。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株分布及质控指标耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株29株全部来自连云港第一人民医院2013年1月—2014年6月临床送检标本,其中分离自痰标本24株,血标本3株,尿标本1株,分泌物标本1株,病区分布:重症监护病区8株,神经内科病区10株,神经外科病区7株,呼吸内科病区3株,儿内科病区1株。所有菌株均经MicroScanWalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统进行细菌鉴定和药敏试验,质控菌株为ATCC25922、ATCC27853。入选标准为厄他培南、亚胺培南或美罗培南三种碳青霉烯药物任一耐药,同时剔除同一患者的重复分离株。1.1.2试剂与仪器3-氨基苯硼酸水合物(3-Aminophenylboronicacidmonohydrate,APBA)(购自上海国药集团化学试剂有限公司)、注射用氯唑西林钠(北京赛孚制药股份有限公司)、MH琼脂干粉、厄他培南(10μg)、美罗培南(10μg)药敏纸片(均购自英国Oxoid公司)、PCRMaster试剂盒、DNAMarker、50×TAE、PCR扩增引物(购自上海生工生物工程有限公司)、稳压稳流定时电泳仪、恒温培养箱、超速离心机、veriti96-孔热循环PCR扩增仪、紫外凝胶成像与分析仪等。1.2方法1.2.1碳绿霉酶表型筛选参照有关文献[3],用无菌生理盐水将待测菌株菌悬液调至1.5×101.2.2碳青霉烯酶基因型的确认加热煮沸法提取细菌DNA1.2.3pfgi试验和mlst分类测试菌株的PFGE实验根椐有关报道方法作适当改进2结果2.1抗菌药物敏感试验所有测试菌株对β-内酰胺类药物100%耐药,只有部份菌株对氨基糖苷类、氟喹诺酮和四环素表现敏感,但这几种药物的总的耐药率均在93%以上。见表2。2.2碳青霉烯酶的筛选碳青霉烯酶表型筛选试验29株均为阳性(美罗培南MEM抑菌圈直径<25mm),双纸片增效试验对29株CRKP进行碳青霉烯酶型筛选结果显示,26株(89.7%)产A类碳青霉烯酶,如图1。7933号对MEM和ETP均≤6mm,对ETP加APBA与不加APBA抑菌圈直径相差>5mm,为产A组碳青霉烯酶;2株(6.9%)产B类金属酶,如图2。8127号标本对MEM和ETP均≤6mm,对ETP加EDTA与不加EDTA抑菌圈直径相差>5mm,为产B组金属酶;1株(3.4%)A、B两类酶筛选试验均为阴性。2.3kpc阳性目的谱带和b类酶基因型筛选经PCR扩增6种碳青霉烯酶的基因,28株碳青霉烯酶酶型筛选阳性菌株均扩增出相关阳性目的条带,其中26株表型筛选为A类酶,KPC基因扩增阳性,如图3。标本号为7933、7700、8007、8838、8993的菌株均扩增出KPC阳性目的条带,基因序列经BLAST网上比对显示均为KPC-2型;2株表型筛选为B类酶,其中一株NDM基因扩增阳性,另一株VIM基因扩增阳性,如图4。标本号为8127的菌株扩增出NDM-1阳性目的条带,基因测序经BLAST网上比对分别为NDM-1、VIM-2型碳青霉烯酶,如图5。BLAST比对显示本次试验中检出的NDM-1耐药基因与Genbank公布的NDM-1耐药基因gb|JN697592.1|同源性为99%。表型筛选试验A、B类碳青霉烯酶阴性1株未测出A、B类碳青霉烯酶相关基因。2.4pfga和mlst分类29株实验菌株的PFGE分型显示,29株CRKP共分为9种不同的PFGE带型,以70%相似度为标准3碳青霉烯酶检测crkp的敏感性分析近年来随着碳青霉烯类药物的广泛使用,耐碳青霉烯肠杆菌分离率不断增加产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的主要机制,自美国于2001年首先报道在一株1996年分离的耐药肺炎克雷伯菌中检测到KPC-1酶以来临床实验室需要一种简单有效的方法快速检出产碳青霉烯酶菌株,改良Hodge(MHT)试验和CarpaNP试验是CLSI推荐作为碳青霉烯酶表型确证试验,但这两种方法在敏感性上还存在一些问题,特别是对产AmpC酶菌株和膜通道蛋白缺失菌株检测的敏感性不够同源性结果显示,本次实验的29株CRKP可分为3个不同的群,26株产KPC-2型酶菌株为同一群,其中17株的条带完全相同,为同一型,这17株分别分离自不同科室非同一时间的不同标本,说明本院存在着产酶菌株在不同科室间的传播和流行,应引起临床各科室和医院感染控制部门的高度重视,采取有效措施切断传播途径,控制耐药株的流行。MLST的结果显示本院主要的流行菌株为ST11型,这和国内报道的流行