生物工程下游分离与纯化课件

生物工程下游分离与纯化生物工程下游分离与纯化让我们从两个实例说起实例一紫杉醇白色结晶体粉末。无臭，无味。水难溶，溶于氯仿、丙酮。紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。1963年美国化学家瓦尼从美国西部大森林太平洋杉（PacificYew）也叫短叶红豆杉树皮和木材分离得到。从红豆杉中如何获得的呢？树皮粉碎85-95%酒精35-55℃热回流浸提三次50-70℃真空减压浓缩氯仿萃取得1%氯仿膏氯仿完全溶解硅胶搅拌均匀干燥过筛装层析柱氯仿-甲醇梯度洗脱浓缩得5～8%半成品丙酮溶解硅胶搅拌均匀干燥过筛装层析柱丙酮－石油醚梯度洗脱浓缩得20～25%半成品丙酮-石油醚结晶3～4次抽滤50℃真空减压干燥得75～80%半成品16Mpa压力层析分离浓缩丙酮－石油醚结晶抽滤干燥，得99．5%成品。严谨而复杂的分离纯化过程！让我们从两个实例说起实例一紫杉醇白色结晶体粉末。无臭，无味从杉树中提取，破坏环境、破坏植物多样性、各国明令禁止！发酵培养1个月20-25℃紫杉醇发酵液预处理过滤滤液萃取收集有机物或纳滤浓缩45℃减压蒸发紫杉醇粗提物大孔吸附树脂脱色提取80%乙腈洗脱硅胶柱层析（去除酯、蜡等杂质）高纯度紫杉醇正己烷结晶真空干燥40℃紫杉醇晶体等体积萃取液

氯仿：甲醇=10:1内生真菌冷冻离心3min8-12h严谨而复杂的分离纯化过程！从杉树中提取，破坏环境、破坏植物多样性、各国明令禁止！发酵培实例二血液透析是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分，并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析。实例二血液透析是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替严谨而复杂的清除代谢废物过程！严谨而复杂的清除代谢废物过程！生物工程下游分离与纯化课件从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的产物或者分离清除出代谢废物的过程至关重要！生物技术专业还开设一门课称为《生物过程下游工艺》从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的生物制品生产过程示意图本课程解决的问题-下游技术上游过程中游技术生物制品生产过程示意图本课程解决的问题-下游技术上游过程中游发酵液/天然动/植物预处理固液分离细胞破碎细胞碎片分离胞外产物初步纯化高度纯化产品及包装加工均质超声研磨溶胞沉降过滤离心粉碎/加热溶解/调pH絮凝或凝聚再凝聚等离心分离萃取过滤沉淀吸附萃取膜过滤吸附色谱分配色谱离子交换凝胶色谱亲和色谱液相色谱无菌过滤超滤冷冻干燥真空干燥喷雾干燥结晶生物分离的一般过程发酵液/天预处理固液分离细胞破碎细胞碎胞外产物初步纯化高度纯What?课程基本内容1.生物工程下游技术的特点和一般流程2.生物样品的预处理

（凝聚、絮凝、沉降、过滤、离心）3.膜分离技术

(微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、透析等）

4.色谱分离技术（吸附/分配/离子交换/凝胶/亲和）

5.离子交换与吸附（阳离子交换、阴离子交换、吸附分离）6.萃取技术（溶剂/双水相/超临界）

7.电泳技术（等电聚焦/毛细管电泳/制备电泳）8.生物样品的精制——浓缩结晶干燥

What?课程基本内容1.生物工程下游技术的特点和一般流生物工程产品的特点

①产物在初始物料中的含量低（氧传递限制；细胞量；产物抑制）②初始原料的组成成分复杂（

大分子;小分子;可溶物;不可溶物;化学添加物）；③产品中有时含有微生物的细胞、代谢产物、残留培养基；④生物活性物质的稳定性差（对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等都十分敏感，易失活变性）；⑤生物发酵产品种类繁多，产物的分子量、结构、性质等往往差异很大；⑥质量要求高(许多产品用作医药、食品、试剂等)。生物工程产品的特点

①产物在初始物料中的含量低（氧传递限生物工程下游分离过程的特点↗满足维持生物物质活性的要求↗满足快速分离的要求↗满足纯度和杂质去除的要求↗满足高效分离的要求↗满足成本优化的要求生物工程下游分离过程的特点生物分离的经济性(1)生物分离至少占总成本50%(2)降低废物排放（有时甚至产品：废物=1:3250)

(3)工艺改造分离工程研发费用与成本研究费用：50%以上产品成本：40-80%人力物力：70-90%因此，生物工程下游技术不可忽视！生物分离的经济性(1)生物分离至少占总成本50%生物分离纯化需满足的要求——具体化①操作条件必须温和，特别是对具有生物活性的物质，在后处理过程中必须保持其生物活性；②分离纯化技术的选择性和专一性强，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高的分离纯化倍数；③目的产物的量和活性具有较高的收率；④在提高单个分离技术效率的同时，注意各单元操作间的整体协调，工艺步骤尽可能的少；⑤整个过程快速。生物分离纯化需满足的要求——具体化分离纯化路线包括两个基本阶段①产物的初级分离阶段★初级分离阶段在细胞培养结束之后，主要是分离细胞和培养液、破碎细胞释放产物（如胞内酶），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂质等。②产物的纯化精制阶段★纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择性的技术手段，将目的产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求。分离纯化路线包括两个基本阶段①产物的初级分离阶段②产物的活性物质分离纯化工艺选择原则质量原则：保证产品的高质量，一是所选择的分离纯化方法要有利于最大程度的去除杂质。二是在分离纯化过程中要防止生物活性物质的降解失活。收率原则：工艺条件优化时，必须考虑收率的最大化。收率与纯度是一对矛盾体，通过工艺优化研究可以使收率与纯度都达到最佳值。时间原则：一是掌握生物活性物质稳定性的时间；二是工艺路线设计时各单元操作所需时间的匹配，尽量节省时间。活性物质分离纯化工艺选择原则生物分离纯化的基本策略下游分离纯化工作前的准备：全面的调查分析，充分地论证；准备充足的实验和生产设备提取工艺：尽可能选择简单的提取工艺分离纯化步骤：①原材料的预处理②颗粒性杂质的去除——固液分离（离心法、过滤法）③可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化（选择性沉淀、膜过滤、选择性吸附以及萃取等技术，去除与目标产物混溶的可溶性杂质；必要时采用集成分离技术）④目标产物的精制（如：层析法和电泳法）工艺放大策略：小试－中试－大规模生产生物分离纯化的基本策略下游分离纯化工作前的准备：全面的调查分生物分离技术与化工分离技术的区别

•化工分离技术：

获得纯的化学物质•生物分离技术：在得到纯的生物物质同时，还必须关注特定杂质的去除；同时保持其生物活性与传统的化学试剂的纯度概念不同，生物产物对有害物质有严格的控制，生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害杂质存在。生物分离技术与化工分离技术的区别

•化工分离技术：生物分离与纯化技术的发展前景——技术应用

生物产品的竞争优势最终归结为低成本和高纯度因此，简化工艺、降低成本和提高质量是生物分离与纯化技术的发展方向。1.研究和开发新型和经济高效的分离纯化技术(1)新型分离介质的研制——色谱分离介质(2)膜分离技术的推广应用(3)提高分离过程的选择性：应用分子识别原理，利用生物亲和作用的高度特异性，结合已有分离技术：亲和层析、亲和膜分离、双水相萃取、反胶团萃取、亲和沉淀、亲和色谱、亲和电泳等(4)强化分离过程的研究——机理研究：综合运用化学、工程、生物、数学、计算等多学科知识和工具，学科交叉，实现新突破2.生物工程上游技术与下游技术相结合3.通过上游工艺条件优化，减少非目的产物——eg.半透膜发酵罐；发酵罐中加入吸附树脂总之：进一步研究和开发高效、低成本的分离与纯化技术必将推动生物技术产业的发展生物分离与纯化技术的发展前景——技术应用

生物产品的竞争优势

细胞破碎技术20研磨细胞破碎技术20研磨21

机械法与非机械法比较21机械法与非机械法比较例3.超滤膜分离原理示意图（2）依据被分离物质的体积大小及与膜的亲和性而得到分离例3.超滤膜分离原理示意图（2）依据被分离物质的体积大中空纤维超滤膜组件中空纤维UF膜特点

◎清洗性好◎均匀微孔分布

◎纤维内径多种规格

◎膜内部阻力小中空纤维超滤膜组件中空纤维UF膜特点卷式反渗透膜组件及不对称膜结构膜组件不对称膜卷式反渗透膜组件及不对称膜结构膜组件不对称膜膜分离压力膜分离压力膜分离技术应用举例膜分离技术应用举例膜分离过程在生物工程中的应用膜分离过程在生物工程中的应用电渗析分离电渗析分离

透析（Dialysis,D)

依浓度差传递低分子量溶质，截留高分子量溶质的过程。透析（Dialysis,D)

依浓度差传递低分子量溶质，亲和膜分离操作方式1.亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩其他成分）

膜孔小2.微孔亲和过滤过程（仅分离目标物）亲和膜分离操作方式1.亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩例1.凝胶渗透色谱的分离原理

依据被分离物质体积大小不同而分离例1.凝胶渗透色谱的分离原理依据被分离物质体积大例2.离子交换色谱的分离过程

利用被分离物质与离子交换树脂的亲和性不同而得到分离例2.离子交换色谱的分离过程利用被分离物质与离子交换萃取技术萃取技术色谱分离法色谱分离法色谱系统的基本组成⑴泵⑵混合器⑶层析柱⑷检测器⑸记录仪⑹分部收集器检测器：吸光度、荧光、折射率、化学发光、电导率等色谱系统的基本组成⑴泵检测器：吸光度、荧光、折射率、化学发抗菌素、维生素、氨基酸、酶制剂、酶抑制剂、菌体制剂、免疫活性剂、生物制品、有机试剂、胞外（内）高分子聚合物等等霉菌放线菌

短杆菌杆菌

球菌

利用微生物作为菌种发酵生产有用物质抗菌素、维生素、氨基酸、酶制剂、酶抑制剂、菌体制剂、免疫活性实例1：聚谷氨酸的分离纯化γ-聚谷氨酸（γ-PGA）结构：D-/L-谷氨酸，γ-酰胺键，1-100万性质：水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、对人类和环境无毒无害实例1：聚谷氨酸的分离纯化γ-聚谷氨酸（γ-PGA）PGA应用领域药物缓释保水剂吸水剂保湿剂增稠剂絮凝剂γ-PGA医药农业环境食品化妆品其他PGA应用领域药物缓释保水剂吸水剂保湿剂增稠剂絮凝剂γ-PG微滤：右侧为外压式中空纤维滤膜，孔径为0.2μm，用于除去发酵液中的菌体。超滤：左侧为内压式中空纤维滤膜，透过孔径约为10-100nm。而聚谷氨酸的重均分子量为30万左右，所以通过超滤可以除去发酵液中的小分子蛋白和糖类等杂质；同时实现浓缩。

微滤去除菌体，超滤去除小分子杂质发酵罐微滤膜和超滤膜微滤：右侧为外压式中空纤维滤膜，孔径为0.2μm，用于除去发通过上一步的浓缩过滤，发酵液的体积可以减少数十倍，此时加入四倍体积的无水乙醇，沉淀得到PGA浓缩液醇沉-离心-透析-冷冻干燥得到产物将沉淀离心，利用透析袋进一步除去小分子物质，然后进行冷冻干燥，得到相对纯净的产品。浓缩液醇沉-离心-透析-冷冻干燥得到产物将沉淀离心，利用透实例2-凝胶色谱法分离单壁碳纳米管单壁碳纳米管（SWCNTs）是由碳原子形成的石墨片层卷成的无缝、中空的管体，可包含一层到上百层石墨层。是一种具有战略意义的新兴材料，它在复合材料、平板显示器、生物传感器、抗电磁干扰材料等方面有广阔的应用前景。目前分离单壁碳纳米管的方法：双向电泳、超速离心等主要问题:产量低、费用高多级凝胶色谱法：基于SWCNTs不同手性结构组分与烯丙基葡聚糖凝胶之间相互作用强度不同而实现分离实例2-凝胶色谱法分离单壁碳纳米管单壁碳纳米管（SWCNTs预实验研究单壁碳纳米管与色谱填料的相互作用Figure1|Effectofoverloadingsingle-wallcarbonnanotubes(SWCNTs)ongelcolumns.请看视频预实验研究单壁碳纳米管与色谱填料的相互作用Figure1不同加载量的SWCNT原液及色谱分离效果

（视频说明）2根色谱柱，填充相同量（1.4ml）的烯丙基葡聚糖填料，柱1、柱2分别加入1ml和8ml分散于2wt%SDS水溶液的SWCNT原液用2wt%低浓度SDS洗脱非结合的SWCNT，得到2种不同颜色的色谱柱：柱1上紫下蓝；柱2为均匀紫色。再分别注入高浓度（5wt%）SDS溶液，洗脱掉结合在色谱填料上的SWCNT，柱1为蓝色；柱2为紫色。可见，不同结构的SWCNT可以选择性地吸附在该凝胶色谱填料上，并由于相互作用强度的不同而实现分离。不同加载量的SWCNT原液及色谱分离效果

（视频说明）色谱分离方法与结果色谱分离方法与结果多种不同手性结构组分SWCNT分离原理示意图分离得到的产物多种不同手性结构组分SWCNT分离原理示意图分离得到的产物得到不同组分的吸收光谱得到的每种组分再重复进行上述凝胶色谱分离过程，便可得到各种不同手性组分和含量的分级产物重复上述凝胶色谱过程分离得到分级产物得到不同组分的吸收光谱得到的每种组分再重复进行上述凝胶色谱分凝胶色谱分离单壁碳纳米管的优点及资料来源本研究依据不同组分单壁碳纳米管与烯丙基葡聚糖凝胶介质之间的相互作用强度不同，实现产物多组分的分离该方法简单、快速、成本低，易于实现单壁碳纳米管的大规模分离.Ref.Large-scalesingle-chiralityseparationofsingle-wallcarbonnanotubesbysimplegelchromatography.

NatureCommunications.2011.5.1-8技术来源于日本筑波先进工业科学与技术国家研究所

（NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,Tsukuba,Japan.）凝胶色谱分离单壁碳纳米管的优点及资料来源本研究依据不同组分单实例3.反胶束萃取技术分离纯化漆酶实例3.反胶束萃取技术分离纯化漆酶WhatIsReverseMicelles?反相乳液生物来源，生物相容性，无毒无害WhatIsReverseMicelles?反相WhatIsRL-basedRME?Rhamnolipid-basedReverseMicelleExtractionWhatIsRL-basedRME?RhamnoSDSAnalysis1CrudeExtract1232AfterRME3MarkerSDSAnalysis1CrudeExTheReuseofReversedMicellarSystem该反胶束萃取体系还能反复利用，既减少环境污染，又节省成本。AO