专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习课件

2016届第一轮复习之——选修1《生物技术实践》绥德县第一中学陕西省•绥德2016届第一轮复习之——绥德县第一中学专题2微生物的培养与应用微生物的分离和培养（培养基、灭菌、倒平板）某种微生物数量的测定培养基对微生物的选择作用利用微生物发酵来产生特定的产物及微生物在其他方面的应用通过本专题的学习，应当掌握培养基、消毒灭菌等有关微生物培养的基础知识，应当掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术，并可以运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数、微生物的分离与培养等实际问题。专题2微生物的培养与应用微生物的分离和培养通过本专题的学习课题1微生物的实验室培养了解培养基的用途、种类及一般成分，掌握培养基制作的一般的步骤，学会一般的消毒、灭毒的方法，进行无菌技术的操作。掌握微生物分离中的划线法和涂布法。体验微生物与现代生物技术之间的密切的关系。课题1微生物的实验室培养了解培养基的用途、种类及一般成分，一、基础知识——微生物（一）.微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻等酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：真核藻类、原生生物病毒、类病毒、朊病毒特点：结构都相当简单，个体多数十分微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。。（如：草履虫、变形虫等）一、基础知识——微生物（一）.微生物的类群微生物原核类:真核1.细菌的形态（1）球菌：球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌，葡萄球菌和链球菌。（2）杆菌：短杆状、棒杆状、梭状、月亮状、分枝状。（3）螺旋状：可分为弧菌（螺旋不满一环）和螺菌（螺旋满一圈以上）细菌1.细菌的形态（1）球菌：球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌，细菌主要是以二分裂的方式进行增殖2.细菌的繁殖3.细菌的菌落⑴.定义：菌落（colony）是由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。⑵.特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。⑶.功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。细菌主要是以二分裂的方式进行增殖2.细菌的繁殖3.细菌的菌落几种菌落及其形态几种菌落及其形态几种菌落及其形态几种菌落及其形态病毒的结构病毒的结构吸附注入合成释放组装病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五个阶段，即：吸附→注入核酸→合成核酸和蛋白质→组装→释放病毒的营养方式：寄生吸附注入合成释放组装病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五个阶段，即放线菌放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，事实上大多数抗生素（广泛应用的抗生素约70%）是各种放线菌所产生。（链霉素、土霉素、卡那霉素、庆大霉素、利福霉素、四环素等等）土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。放线菌放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在真菌真菌，是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母真菌的异养方式有寄生和腐生。真菌真菌，是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也原生生物原生生物(protist/protoctists)大部分都是单细胞生物，比原核细胞更大、更复杂。有些原生生物可以利用光合作用制造食物，原生生物界至少包含5万种的生物。健康食品，如绿藻的绿胞藻和连营藻，蓝绿藻的螺旋藻等。有些藻类可以食用发菜，群带菜，紫菜、龙须菜和菩提藻原生生物原生生物(protist/protoctists芽孢

有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌自养菌:分类异养菌:腐生菌例如枯草杆菌寄生菌例如寄生在肠道内的痢疾杆菌

(大部分病原菌)细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为70%以上的天然抗生素均由土壤放线菌产生。如头孢拉定、链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素、春雷霉素、四环素、红霉素和卡那霉素等。70%以上的天然抗生素均由土壤放线菌产生。二、培养基的概念、种类及营养构成1、概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。2、培养基的分类根据化学成分天然培养基合成培养基半合成培养基根据培养基外观的物理状态液体培养基半固体培养基固体培养基根据培养基的功能基础培养基选择培养基鉴别培养基二、培养基的概念、种类及营养构成1、概念：人们按照微生物对是指采用动植物组织或微生物细胞及它们的提取物或粗消化物配制而成的培养基。优点：取材便利、营养丰富、配制简便缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性差(成分不明确)如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等天然培养基合成培养基是指由准确称量的分析纯等高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的培养基。优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好缺点：配制繁琐、成本较高如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等根据化学成分半合成培养基是指采用部分天然物质和部分化学试剂配制而成的培养基。优点：兼有天然培养基和合成培养基的一些优点如马铃薯蔗糖培养基是指采用动植物组织或微生物细胞及它们的提取物或粗消化物配制而根据培养基外观的物理状态液体培养基：微生物或动植物细胞的液状培养基需要进行通气培养、振荡培养。这种培养基常用于鉴定菌种和计数。半固体培养基：培养液中加入少量的凝固剂（琼脂）制成了半固体培养基。常用于观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定等固体培养基：在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基，培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。明胶是最早使用的固体培养基凝固剂,已逐渐被琼脂所代替.琼脂由于形成凝胶后透明度高、保水性好、无毒、不被微生物液化等优点,逐渐成为最常用的凝胶剂.后来,又发现无机硅胶、瓜尔胶、卡拉胶在某些情况下可用作凝固剂.近年来,兴起一种基于微生物快速检测的快速测试片,其所用凝固剂发展到黄原胶、刺槐豆角、聚丙烯酸系等.但新型凝固剂在使用过程中仍存在许多弊端,因此,从吸水和保水的机理出发对其研究和改性是一项重要的任务.琼脂特性是它的凝点40℃和熔点95℃之间的温度相差很大，凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。由于它是高分子化合物所以微生物不能利用。根据培养基外观的物理状态液体培养基：微生物或动植物细胞的液状基础培养基基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细菌生长。基础培养基是配制特殊培养基的基础，也可作为一般培养基使用。如在牛肉浸液中加入适量的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节pH7.2～7.6，经灭菌处理后，即为基础液体培养基；如再加入0.3%～0.5%的琼脂，则为基础半固体培养基；加入1%～2%的琼脂，则为基础固体培养基。根据培养基的功能鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如伊红和美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落带有金属光泽,可以用来鉴别大肠杆菌大肠杆菌分解乳糖产生大量混淆酸，可染上酸性伊红，伊红又和美蓝结合，菌落被染成深紫色，从菌落外貌的发射光中还可以看到绿色金属发光基础培养基基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可选择培养基选择培养基——在培养基中加入某种化学物质或除去某些营养物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长加链霉素可抑制细菌和放线菌的生长,将真菌分离出来。（链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长,对酵母菌和霉菌不起作用.加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌.）加高浓度的食盐抑制多种细菌生长,分离到金黄色葡萄球菌。无氮培养基可用以选择能固氮的细菌。不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物加富培养基：是指在培养基成分的营养物质仅适合一种或一类微生物，从而使此类生物生长繁殖较快淘汰其他微生物选择培养基选择培养基——在培养基中加入某种化学物质或除去某些3、培养基的成分营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。微生物的碳源概念：能为微生物提供所需碳元素的营养物质来源：无机碳源：CO2；NaHCO3等有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等作用：构成细胞物质和一些代谢产物异养微生物的能源微生物的氮源概念：能够为微生物提供N元素的营养物质。来源：无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等作用：主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。二、培养基的概念、种类及营养构成对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。3、培养基的成分营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件三、无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）常用方法1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒①灼烧灭菌②干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。③高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min等.适用对象操作空间、某些液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等三、无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操化学药剂的消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强，浓度过低，杀菌力弱，浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形，成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，因此杀菌效果受影响。微生物的接种工具接种环、接种针或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧化学药剂的消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件3.具体操作①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。⑴培养细菌用的培养基与培养皿⑵玻棒、试管、烧瓶和吸管⑶实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。3.具体操作1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外(1)计算：依据是培养基配方的比例。

(2)称量：牛肉膏比较黏稠，可同称量纸一块称取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。

(3)溶化：牛肉膏和称量纸+水加热取出称量纸→加蛋白胨和氯化钠→加琼脂（注意：要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂）→补加蒸馏水至100mL。(4)灭菌：将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min；培养皿可用干热灭菌。(5)倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素蛋白胨主要提供氮源和维生素。四、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（一）、制备牛肉膏蛋白胨培养基(1)计算：依据是培养基配方的比例。

(2)称量：牛肉膏比较答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发（也有说防止水分过快散失）,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚倒平板操作倒平板操作牛肉膏（BeefExtract）又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备牛肉膏（BeefExtract）又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛蛋白胨peptone蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类可用作微生物和动物细胞培养基

蛋白胨peptone蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解酵母浸膏酵母浸膏（酵母膏）是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素。主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子。一般的用量为0.2%～2.0%。酵母浸膏酵母浸膏（酵母膏）是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自pH、温度、时间——了解最适pH

细菌：6.5-7.5

放线菌：7.5-8.5

真菌：5.0-6.0采用pH试纸测试，一般用3%的HCl或NaOH溶液调节培养温度和时间细菌：30-37℃1-2d

放线菌：25-28℃5-7d

真菌：25-28℃3-4dpH、温度、时间——了解最适pH培养温度和时间牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下牛肉膏3g蛋白胨5g氯化钠3g琼脂20g自来水1000mLpH7.0~7.2灭菌1.05kg/cm2，25~30min牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基，其配方如下：

去皮马铃薯（或鲜豆芽200g

蔗糖20g

自来水1000mL

琼脂20g

pH自然

灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm220min马铃薯蔗糖琼脂培养基用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养高氏一号培养基用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：可溶性淀粉20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4•7H2O0.01gpH7.4~7.6

琼脂20g自来水1000mL

灭菌：1.05kg/cm230min高氏一号培养基用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如四、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（二）、分离纯化大肠杆菌通常把无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。方法：微生物的接种的常用接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（2）稀释涂布平板法：将骏业进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。四、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（二）、分离纯化大肠杆菌通（1）平板划线操作：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；同时存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。（二）、分离纯化大肠杆菌方法：（1）平板划线操作：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离（1）平板划线操作：①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。④等平板凝固后，将平板倒置。（1）平板划线操作：专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养基杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染或感染操作者划线分离操作中的有关问题：（1）在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。（2）在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在进行第二次以及其后的划线操作时'要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌方法：（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌方法：（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌方法：（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌方法：（二）、分离纯化大肠杆菌培养、鉴定：将接种后的培养基和一个未接种的培养基（对照组）都放入到37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。最适pH

细菌：6.5-7.5

放线菌：7.5-8.5

真菌：5.0-6.0培养温度和时间细菌：30-37℃1-2d放线菌：25-28℃5-7d真菌：25-28℃3-4d菌种保存：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。⑵.长期保存：甘油冷冻管藏法⑴.临时保藏：（二）、分离纯化大肠杆菌培养、鉴定：最适pH培养温度和进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则茵落中的细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。培养后判断是否有杂菌污染的方法从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上结果分析与评价㈠.培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。㈡.接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。㈢.是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。结果分析与评价㈠.培养基的制作是否合格课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与纯化1．分离菌株的思路(1)自然界中目的菌株的筛选①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度.pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。（一）土壤中分解尿素的细菌的分离课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与纯化1．分离菌株的思路2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。3、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：该培养基的配（二）统计菌落数目微生物计数通常有：利用计数板直接计数（血球计数板——显微镜）和利用菌落数间接计数1、理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。菌落数间接计数2、原理：1个菌落→1个活菌①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值，需培养计算出三个或三个以上的平板菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。3、注意事项血球计数板直接计数——不能区分死活（二）统计菌落数目微生物计数通常有：利用计数板直接计数（血球土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定（二）实验流程（1）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先灭菌过的信封中。（2）制培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。选择较为宽泛的稀释范围，稀释倍数为103-107;每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基；准备8个灭菌试管和1个灭菌移液管。土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基（3）样品稀释涂布

每个稀释度均用3个选择培养基。稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/g）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性的提供选择培养的条件。（3）样品稀释涂布

每个稀释度均用3个选择培养基。稀释倍数目（4）微生物的培养与观察

最适pH

细菌：6.5-7.5

放线菌：7.5-8.5

真菌：5.0-6.0培养温度和时间细菌：30-37℃1-2d

放线菌：25-28℃5-7d

真菌：25-28℃3-4d注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30℃下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生红色反应。（4）微生物的培养与观察

最适pH培养温度和时间（5）细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30-300的平板进行计数。在同一稀释度下至少对3个平板进行重复计数，求出平均值，然后根据平板对应的稀释度计算样品中细菌的数目。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。设置对照目的排除实验组中非测试因素对实验结果的影响。什么是对照实验？除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，称为对照实验。通过书中的案例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设臵是必不可少的。（5）细菌的计数设置对照目的专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件专题2-微生物的培养与应用-第一轮复习ppt课件⑵稀释涂布平板法：涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍⑵稀释涂布平板法：涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，酚酞和酚红有什么区别酚酞酚红酚红指示剂是由酚红所配制成的0.02~0.05%的醇溶液。当被测溶液的pH值小于6.8，则指示剂呈现黄色的酸性反应；若被测溶液的pH值大于8.4，则指示剂呈现红色的碱性反应酚酞是一种弱有机酸，在pH＜8.2的溶液里为无色的内酯式结构，当pH＞10时为粉红色的醌式结构，是一种常用的酸碱指示剂（变色范围pH值8.2-10.0，由无色变红色）。酚酞的醌式或醌式酸盐，在碱性介质中很不稳定，它会慢慢地转化成无色羧酸盐式；遇到较浓的碱液，会立即转变成无色的羧酸盐式。所以，酚酞试剂滴入浓碱液时，酚酞开始变红，很快红色退去变成无色。酚酞和酚红有什么区别酚酞酚红酚红指示剂是由酚红所配制成的0.课题3分解纤维素的微生物的分离一、纤维素与纤维素酶纤维素（cellulose）是由葡萄糖组成的大分子多糖。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纤维素含量接近100%，为天然的最纯纤维素来源。植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中。许多商品纤维素都是由天然纤维素制得:如水溶性的羧甲基纤维素钠(CMC--Na);不溶于水的微晶纤维素等食品添加剂。纤维素是重要的造纸原料，此外广泛用于塑料、炸药、电工及科研器材等方面。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌。课题3分解纤维素的微生物的分离一、纤维素与纤维素酶纤维素（纤维素酶的活性测定实验——滤纸崩溃法纤维素酶的活性测定实验——滤纸崩溃法二、纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选方法刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选纤维素分解菌的筛选方法的原理刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌二、纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选方法纤维素分解菌的筛三、实验设计实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。②在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。三、实验设计实验原理：1、土壤取样选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。2、选择培养*（此步可以省略）选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。可用用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。操作方法：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。在选择培养的