分子生物学与基因工程实验报告

分子生物学与基因工程试验报告绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景学问绿色荧光蛋白〔greenfluorescentprotein，GFP〕是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等GFP放射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的GFP32.6kbGFP238个氨基酸所组成的单体蛋白,27.0kMr601996GFP420nm240nm11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开头的，桶的顶部由3个重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67Ser-Tyr-Gly1996年GFP420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开头的,桶的顶部由3个短的垂直片段掩盖，底部由一个短的垂直片段掩盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达一、试验目的学习把握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培育物中抽提质粒DNADNADNA的酶切、PCR甚至测序。DNA切酶进展DNA酶切的原理和方法。了解和把握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。把握双酶切法鉴定重组质粒DNAPCRDNAPCR法IPTGGFP基因表达的根本原理及根本操作步骤。本试验除了训练学生用聚丙烯酰胺凝胶电泳分别蛋白质外质这一分子生物学的重要技术。二、根本原理DNA的分别与纯化的原理：DNA1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在确定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数状况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是一样的。有些质粒复制受宿主细胞复10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时〔例如经氯霉素处理DNA可连续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。DNA用人为的方法转的表型特征，可证明质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。DNA分子。目前已有很多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个根本的步骤：细菌的生长和质粒的扩DNADNA的纯化。细菌的生长和质粒的扩增松弛型质粒〔pUC系列〕来说，只要将培育物放到标准的LB2YT培育基中生长到对数DNA〔如pBR322〕选择性扩增。DNA的分别质粒分别的根本原理是利用宿主菌〔一般是大肠杆菌菌株〕DNADNA之间的两1〕大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒A〕从细胞中提DNA主体是变性的线性分子DNA是共价闭合的环状分子。SDS〔十二烷基硫酸钠〕和NaOH使菌体裂解〔有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时〔如参与酸性的c或c中和碱性，质粒A链快速得到准确配对，DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简洁步骤除去剩余RNA，到达纯化的目的。DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA〔cccDNA，SC构型、开环DNA〔OC构型〕和线性分子〔L构型DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量一样，但具有不同的电泳迁移率。其SCDNALDNAOCDNA。琼脂糖凝胶电泳的原理：影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有1DNA分子的大小双链DNA分子〔2〕琼脂糖浓度给定大小的线状DNADNA凝胶浓度之间存在线性相关〔3〕DNA的构象超螺旋环状〔Ⅰ型、切口环状〔Ⅱ型〕和线状〔Ⅲ型〕DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶件下，Ⅰ型DNA〔4〕所用的电压低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度上升时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分别的有效范围反而减小。要获得大于2kbDNA5-8V/cm〔5〕电泳缓冲液DNA缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时〔如1×buffe，电导率上升，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严峻时凝胶会熔化，DNA酶切及连接的原理：迄今已觉察了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶依据亚基组成、酶切位II型酶在其识别位点之中或接近确实定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoRI、HindIII、BamHINotI这样在识别序列中进展到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列〔如EcoRIGAATTC；HindIIIAAGCTT;BamHI识别GGATCC;NotI识别GCGGCCGC；而另一些识别不连续的序列〔BglI识别。限制性内切酶酶切A两条链断裂的位置是EcoRI酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称构造HaeIIIDNADNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条A链的3-末端具有一个游离的羟基，和在另一条A链的5-末端具有一个磷酸基团。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够承受DNACaCl2长的大肠杆菌细胞在0℃下参与到低渗的CaCl溶液中，便会使细胞膜的透性发生转变，此2时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可到达5×106-2×107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。0DNA可吸附到感受态细胞外表，短时间的热刺激〔42℃，90s〕诱导细胞DNA。转化了质粒DNA371hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培育基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。DNA的鉴定〔PCR法〕的原理：DNA是利用限制性内切酶〔BamHINotI〕分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有一样的粘性末端连接起来的重组质粒，假设再利用一样的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点DNA是否为重组质粒。单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反响〔PolymeraseChainReactionPCR〕DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延长等三步反响组成一个循环周期，通过屡次循环反响DNA得以快速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚7235’→3’方向延长，合成DNA的互补链。RAq酶，脱氧核苷三磷酸底物和靶序列〔即模板〕等五局部组成，缺一不行。PCR技术能在试管中建立反响，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106DNA拷贝。它操作简洁，易于把握，结果也较为牢靠，为基因的分析和争论供给了一种强有力的手段，对整个生命科学的争论与进展都有深远的影响。因此，PCR技术产生的时间虽不长，却以的诊断、肿瘤机制的探究及法医鉴定等诸多方面。GFP蛋白的诱导表达的原理：〔L半乳糖苷是一种常见的诱导基因表达的诱导剂P基因连接到a的多克隆位点P基因的表达受其上游7启动子和操纵基因OLacI四聚体的形式结合到操纵基因OGFP基因的表达。IPTG可与四聚体调整蛋白结合，从而转变调整蛋白的构象，使调整蛋白不再与O位点结合。接着BL21T7RNAT7GFP基因的表达。Western-blotting的原理：蛋白质印迹〔Western-blotting〕是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，利用抗原-抗体反响原理，以一抗作为探针，与目的蛋白作用并连接，再用带有标记的二抗与一抗作用，最终显色，显色位置即为目的蛋白。这种以高强力形成印迹的方法被称为Western-blotting技术。B淋巴细胞承受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体〔Moncloneantibody〕有多种抗原打算簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗隆抗体由于其可识别多个抗原表位第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。其次抗体是能和抗体集合产生的免疫球蛋白，即一抗充当抗原刺激机体产生的抗体。二抗上带有可以被检测的标记，如荧光、放射性、化学发光或显色集团。His标签是蛋白质重组技术中常常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸，其特点是分为便利。His标签抗体可以用于检测和His标签融合蛋白的表达、细胞内定位，以及定性或定量检测His融合表达蛋白等。免疫印迹的试验包括5个步骤：SD并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。封闭〔blocked〕：保持膜上没有特别抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上，并与蛋白质反响。初级抗体〔第一抗体〕是特异性的。其次抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反响。三、试验材料、仪器及试剂1．试验材料含pEGFP－N3大肠杆菌液和含pET-28aDNA的大肠杆菌液，DH5α，BL21，pET-28a重组质粒DNA，正向引物：5’-gggCATATggTgAgCAAgggCgAgg-3’，反向引物：5’-gggCTCgAgTTACTTgTACAgCTCg-3’，第一抗体〔兔源His标签抗体〕，其次抗体〔羊抗兔Ig多克隆抗体〕。2．使用仪器恒温培育箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、掌中宝离心机、小型混合PCR仪、1.5m离心管、蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套〔百晶公司，硝酸纤维素滤膜，直径为20cm和10cm的培育皿各一个，剪刀、镊子、刀片，一般滤纸。3．试剂BamHI(10U/μL)(TaKaRa公司)，NotI(10U/μL)(TaKaRa公司)，T4ligase、1%琼脂糖凝胶，LB〔Luria-Bertain〕液体和固体培育基四、试验步骤质粒DNA的分别与纯化：取2.0mlDH5α培育液倒入2.0mL离心管中，13000rpm离心1min。重复1。弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需猛烈振荡)，室温下放置10min。参与配制的溶液Ⅱ200μL〔SDS与NaOH等量混匀〕，盖紧管口，快速温存颠倒离心管5次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5min。参与150μL3次，使沉淀混匀，冰浴中15分钟，13000rpm离心10min。吸取400μL上清液移入干净离心管中，参与800μl等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，振荡混匀，静置10min〔可重复〕。将水相300μL移入干净离心管中，参与800μl等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀，13000rpm离心2min。210min，然后13000rpm离心10min。弃上清。吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温枯燥。将沉淀溶于30μLddH2O18μL12μL保存在-20℃冰箱中。pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃冰箱中。酶切及连接按如下双酶切体系〔30μL〕混合：反响物

pEGFP-N3〔μL〕pET-28a〔μL〕质粒 18 18BamHI 2 2NotI 2 210×bufferK 3 3ddH2O 5 5〔1〕372-3h。1.0%〔M/V〕30ml。适当放置冷却，60℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。待凝胶凝固好以后，拨下梳子。酶切样品中参与5µl上样缓冲液〔含GeneFinder〕混匀，全部上样。〔6〕1×TBEBuffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。观看结果，并且拍照。用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。以0.1g凝胶对应300μL的体积参与PN。50℃水浴放置10min，期间不断温存上下翻动离心管至胶完全融解。将上一步得到的溶液参与到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，静置3min再在13000rpm离心60s，弃掉废液。参与750μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液，重复一次。EB30μL，洗脱缓冲液先室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。依据以下连接体系进展，16℃或室温下连接过夜。反响物回收纯化的pET-28a质粒gfp基因片段T4连接酶缓冲液〔10×〕

体积/μL51212大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1感受态细胞的制备(CaCl2将活化的DH5α或BL21培育液转入2mL10min，然后于4℃下4000rpm离心5min。0.1mol/L的CaCl600μL20min,4℃2下4000rpm离心5min。弃去上清，参与300μL预冷的0.1mol/L的CaCl溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，2即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存。3.2转化涂板〔1〕取2个无菌离心管，分别参与100μLDH5α感受态细胞悬液，第1管加5μl无菌水，第2管参与质粒DNA溶液5μl，轻轻摇匀，冰上放置30min。〔2〕42℃水浴中热激90s，热激后快速置于冰上冷却5min。分别向管中参与100μLLB液体培育基,混匀后在37℃振荡培育30min。从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50μL涂布于含抗生素的平板上。正面对上放置约10分钟,待菌液完全被培育基吸取后倒置培育皿,37℃培育20小时。凝胶成像系统采集图片。11250μL50μL50μLddH2OddH2O重组质粒重组质粒DNA的鉴定〔菌落PCR法〕挑取菌落随机挑取1个菌落。首先使用无菌枪头挑取菌落，在已预备好的含有卡那抗菌素，分好区的固体培育基中轻划一下〔为保菌种〕，然后将余下菌置于离心管中〔作为PCR反响模板〕。PCR反响体系〔20μl〕反响物体积/dNTP〔10mM〕2左引物0.5右引物0.5Taq酶〔5U/μL〕0.5MgCl(25mM)21.210×BufferddHO2

213.3PCR循环：95℃5min予变性〔95℃30s；58℃30s；72℃60s〕30cycles72℃10min延长PCR产物的检测PCR产物参与5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液，分别按编号参与DNA琼脂糖凝胶电泳的加样孔，使用1%琼脂糖电泳分别。用荧光激发器看结果采集照片。GFP蛋白的诱导表达取3组培育好的含重组质粒DNA的大肠杆菌液2ml与2ml离心管中，参与IPTG3μL，分别诱导0h，1h，2h。分别取1.5ml，10000rpm离心5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。观看蛋白表达：用紫外线照耀菌体沉淀及培育平板，可以看到绿色荧光。分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。6.Western-blotting蛋白质电泳洗净电泳用的玻璃板，晾干，按仪器使用说明装好。配12％分别胶8mL,分别取：30％丙烯酰胺1.5MpH8.8Tris-HCl〔分别胶缓冲液〕3.2mL，2.08mL，10％SDS8μL，TEMED10μL，双蒸水2.64mL混匀后加10％过硫酸铵30μL混匀，灌胶。灌好分别胶，上面用双蒸水封好。待分别胶凝固后(凝胶时间半小时左右)，配6％浓缩胶〔2.3ml〕：30％丙烯酰胺 0.45mL，0.5MpH6.8Tris-HCl0.6mL，〔浓缩胶缓冲液〕10％SDS 22.5μL，TEMED 2μL，双蒸水 1.2mL，混匀后加10％过硫酸铵 20μL。混匀。吸净上面的水，灌入浓缩胶，插入梳子，凝固半小时以上。待胶凝固后，拔出梳子，参与电泳缓冲Buffer。沉淀用200μL1×SDS上样缓冲液悬浮，煮3分钟，12023rpm离心5min，取上清。Marker〔5μL〕，样品〔15μL〕，Marker，样品。开头电泳时用80V，待样品全部进入胶后增大到160V。溴酚蓝指示剂电泳到分别胶底部时〔距底部1.5cm左右〕，停顿电泳。聚丙烯酰胺电泳后，将凝胶从中间位置切成两等份。第一份胶用于考马斯亮蓝染色：先用固定液固定半个小时〔可省〕，再用考马斯亮蓝染色液染色0.5小时，然后脱色2个小时。电泳转移转移其次份胶，切割有效局部。〔N正面〕。在转移板上按挨次操作，每一步不能有气泡：①用转移Buffer浸湿后的海绵片一张〔接触转移板黑色局部〕②用转移Buffer浸湿后的一般滤纸两张③放上切割好的胶④胶上放硝酸纤维素膜，正面贴胶⑤湿滤纸两张⑥湿海绵片一张〔接触转移板白色局部〕合上转移板，放入电泳槽，留意电极胶靠负极。倒入300mL转移缓冲液〔甲醇现用现加〕。120mA恒流电泳1.5h。转移完毕后，取出硝酸纤维素膜。免疫印迹用TBS缓冲液洗膜10min，在摇床上轻轻摇动。将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻轻摇动45min。轻轻地转移掉封闭溶液，并用TBS溶液洗膜两次。悬浮洗膜一次，其次次10min。将1块润湿的滤纸放在大平皿中，滤纸上放一块比滤纸稍小的Parafilm膜。取500μL一抗溶液〔一抗原液：封闭液＝1：500〕在Parafilm膜上面均匀点上液滴。将纤维素膜蛋白面〔即硝酸纤维素膜正面〕朝下铺在一抗上，之间不要有气泡。盖盖保湿室温过夜。去掉第一抗体溶液，用TTBS洗膜3次，每次10min，置于摇床上轻轻摇动。依据和一抗同样的操作将纤维素膜贴在二抗上〔羊抗兔的辣根过氧化酶〕。二抗：抗体稀释液按1：500稀释。室温结合1.5h。用TTBS洗2次，每次10min〔为了更好的看到免疫的条带，可洗一次至两次〕。用TBS溶液洗膜一次。显色〔试剂盒〕。用平皿预备10mLTBS，预热到60℃，取20μlDAB母液〔20×〕20μL过氧化氢〔20×〕，混匀，快速参与硝酸纤维素膜，晃动5min，等条带显出来以后，加去离子水终止反响，用滤纸保存。〔刘佳楠、李洁〕已做好观看条带，然后照相。五、试验结果与分析1.质粒DNA的分别与纯化〔琼脂糖凝胶电泳〕图1琼脂糖凝胶电泳在蓝盾可见光透射仪下观看的结果〔按挨次：1.N32.N3GFP基因的质粒3.Marker4.28a没有酶切的5.28a酶切后的〕结果：28a质粒经双酶切后电泳得到一条带，该带切下后可作为质粒载体；