基因工程课件章

基因工程课件章第1页，课件共53页，创作于2023年2月一．DNA的限制酶反应

1.酶单位定义:

使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。

2.酶切反应类型

1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)

2)部分酶切

3.酶切反应最适条件

1)DNA分子的组成

i.碱基组成与排列方式

ii.识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位点）

2)反应条件

i.DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度）依实验目的而定HpaI(CCGG)126ThaI(CGCG)023第2页，课件共53页，创作于2023年2月

ii.限制酶的纯度和稳定性

i)纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件

ii)稳定性：保存和反应

iii.反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值

iv.反应温度：大多数为37℃

v.

双酶切和多酶切反应同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者--分别酶切。

i)第一种酶切电泳检查酚/氯仿纯化第二种酶切。可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。

ii)采用低浓度盐缓冲液的限制酶切电泳检查采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。

如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)第3页，课件共53页，创作于2023年2月二、限制酶图谱的绘制

1.完全酶切作图法

1）单酶切作图法一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。

i.单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。第4页，课件共53页，创作于2023年2月

ii.末端标记完全酶切

DNA片段末端标记完全酶切凝胶电泳EtBr染色观察放射自显影

2)

双酶切作图法单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行第5页，课件共53页，创作于2023年2月分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图根据上述的原理和步骤，前述的5Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一：

i)单酶切分离DNA片段第二种酶切凝胶电泳

ii)单酶切第二种酶切凝胶电泳*如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。

第6页，课件共53页，创作于2023年2月

2.末端标记-部分酶切作图法（Smith-Brinstiel法）

DNA片段末端标记酶1切分离带标记DNA片段酶2部分酶切电泳EtBr染色照相放射自显影结果单端标记方法:

人工合成单端标记法

限制酶切单端标记法第7页，课件共53页，创作于2023年2月单端标记方法1

人工合成单端标记法第8页，课件共53页，创作于2023年2月单端标记方法2

限制酶切单端标记法第9页，课件共53页，创作于2023年2月

3.末端标记双相作图法方法2仍存在两个不足之处：①酶1的选择不能靠近DNA中央；②需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。现假设有一片段长10Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:第10页，课件共53页，创作于2023年2月4.Bal31顺序酶解作图法

DNA片段Bal31处理不同时间取样终止反应限制酶切凝胶电泳染色观察结果5.切口移位作图法(可检测出100bp片段)

双链DNA切口移位限制酶切电泳放射自显影第11页，课件共53页，创作于2023年2月6.大尺度限制酶作图

1)

条件

i.

电泳方法脉冲场凝胶电泳

ii.

样品制备原位DNA制备和酶解

iii.

人工染色体构建pYAC载体构建

iv.

脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在

2)

一般作图程序原位DNA样品制备原位DNA限制酶切脉冲场凝胶电泳染色观察

3)

大尺度作图用酶

i.

稀有识别序列内切酶I型内含子内切酶(真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA

虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用第12页，课件共53页，创作于2023年2月

ii.

II型限制酶人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因的5’-端,未被甲基化的CpG岛平均长约270kb

可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列

i)

AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)

FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)

SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)

CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)

BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)

NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)

MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,

SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3第13页，课件共53页，创作于2023年2月三.

限制酶图谱的用途

1.

基因工程中的应用

1)

克隆载体图谱,便于DNA重组;2)

克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序.

2.

突变体检测遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了基因型和表型的变化.

限制酶图谱不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即表型的变化不一定会导致酶谱变化.1)

缺失突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较小DNA片段.2)

插入突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.第14页，课件共53页，创作于2023年2月缺失和插入突变体的检测（I）III点突变的检测（II）第15页，课件共53页，创作于2023年2月

3）点突变的检测:某DNA片段消失,代之以两较小的DNA片段.前者的长度等于后两者长度之和(位点增加)；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段，前者的长度之和等于后者长度(位点消失).

3.

重组频率的测定同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗传多型性.等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不同个体总DNA限制酶完全酶切Southern印迹杂交结果分析第16页，课件共53页，创作于2023年2月当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为:表型红:白=1:1,限制酶谱30%个体已发生了重组.

4.

遗传疾病的诊断分析正常人与遗传病患者的某些DNA片段的限制酶谱,便可发现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.第17页，课件共53页，创作于2023年2月第五节DNA的连接

第18页，课件共53页，创作于2023年2月一.DNA的连接方法两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构.1.直接连结法该法适用于:1)

同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端

重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外(如AraI)2)不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端

i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体的连接

4)限制酶和其他方式产生的平整末端.第19页，课件共53页，创作于2023年2月2.人工接头连接法1)人工接头（linker）的结构

i.中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶识别位点

iii.某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如:

八聚体d(GGAATTCC)

十聚体d(CGGAATTCCG)

十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火第20页，课件共53页，创作于2023年2月

ii.产生新的克隆位点

iii.合成匹配接头3)连接方法

人工接头磷酸化退火形成双链与目的DNA相连限制酶切两DNA分子相连4)适用范围

人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的DNA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.第21页，课件共53页，创作于2023年2月3.匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接头的结构特点

i.

由两个低聚核苷酸组成

ii.部分区域可以互补

iii.退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)

匹配接头的种类第22页，课件共53页，创作于2023年2月

i.

预制匹配接头(连接平端和粘性末端)

人工接头+匹配接头预制匹配接头

ii.转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接头退火转换匹配接头二人工接头连接酶双酶切转换匹配接头

iii.单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾连接法在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC.5.连接方法的选择方法选择的依据:1)两DNA分子的末端结构

2)DNA分子的限制酶谱

3)是否需要回收DNA片段第23页，课件共53页，创作于2023年2月连接方式的选择载体末端外源DNA末端常规连接脱磷酸化同聚物平端连接补齐,人工接头

结构结构载体加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二选择第一选择不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能结合使用接头不能不能第一选择

3’-突起相容3’-突起唯一选择不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一选择不能第二选择或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一选择不能第二选择

(补齐后)

平端平端不能可能可能第一选择可能平端3’-或5’-突起不能不能第一选择不能第二选择第24页，课件共53页，创作于2023年2月二.DNA的连接反应

1.

连接反应理论当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关:1)

连接反应系统中的总DNA浓度i2)

一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化)3)

两种不同DNA分子的克分子浓度之比值.2.

连接反应条件

1)

评估连接反应结果的方法

i.

琼脂糖凝胶电泳

ii.大肠杆菌转化

2)

反应条件第25页，课件共53页，创作于2023年2月

i.

温度

ii.ATP浓度

iii.时间

iv.连接酶浓度

v.克分子比率第26页，课件共53页，创作于2023年2月第六节

PCR技术第27页，课件共53页，创作于2023年2月一．DNA体外扩增技术

1.

PCR反应体系

1)基本原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应)

一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物

2)基本操作待扩增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两引物90℃变性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′进入第二次循环25-30次循环第28页，课件共53页，创作于2023年2月PCR原理示意图第29页，课件共53页，创作于2023年2月2.PCR产物的鉴定

1)PCR产物的大小和限制酶谱分析2)寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）

OR分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用第30页，课件共53页，创作于2023年2月PCR产物的OR鉴定第31页，课件共53页，创作于2023年2月3)分子杂交适合于检测PCR产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性DNA片段作探针(常为人工合成的一段低聚核苷酸，约20n.t.).当这种探针的核苷酸序列与待测的DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificOligonucleotide,ASO）与PCR产物进行杂交，可检测出PCR产物的碱基突变。可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析第32页，课件共53页，创作于2023年2月

4)核苷酸序列分析

DNA扩增产物变性与末端标记的扩增引物或定序引物退火双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列第33页，课件共53页，创作于2023年2月二．TaqDNA聚合酶的特点

TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶的分子量为63-68kD

1.无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的5’3’外切酶活性

2.最适反应温度为80℃

3.最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl

4.最佳二价阳离子Mg2+

（10mM）

5.具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有70%的酶活第34页，课件共53页，创作于2023年2月TaqDNA聚合酶的特性第35页，课件共53页，创作于2023年2月当采用TaqDNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：

1）热稳定性：在PCR循环中DNA的变性时间常为30-60″，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保温30′仍具有70%酶活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化*2）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配对的特异性大大降低，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于TaqDNA聚合酶最适反应温度为80℃，退火温度可提高到55℃以上，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使产物均一性大大增加**3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用TaqDNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4×106***4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段的扩增，这就要求DNA聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使扩增片段达2Kb。当利用TaqDNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4Kb.第36页，课件共53页，创作于2023年2月

经改造的TaqDNA聚合酶可扩增出40kb的DNA片段.5）扩增产物的可靠性：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为10-4，TaqDNA聚合酶的错误掺入率为5×10-3

，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7。

*注：1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高，引物与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。引物的长度常为20-28聚体，其中有50%以上的GC含量，无自身互补序列，特别是3'末端不应有内部二级结构，引物加量为每100μll20pmol.**2)出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。***3）链延伸长度与延伸时间有关，对于TaqDNA聚合酶，每分钟可形成2000n.t.或更多。如果要扩增3-4Kb的DNA，在72℃下需将酶延伸时间增至3-4分钟。第37页，课件共53页，创作于2023年2月三．PCR方法

1.

强化PCR（BoostedPCR）将PCR分为两个阶段：

1）引物与模板之比为107，扩增20个周期

2）引物与模板之比为1012–1013，再扩增10个周期该法适合于待扩增DNA浓度较低时。

2.混合寡核苷酸引物PCR（mixedoligonucleotideprimedamplificationofcDNA,MOPAC）根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一特定cDNA进行扩增。

3.锚定PCR(AnchoredPCR，A-PCR)第38页，课件共53页，创作于2023年2月4.连结PCR(ligationmediatedPCR)

该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用第39页，课件共53页，创作于2023年2月5.不对称PCR(AsymmetricalPCR)采用不同引物浓度比率，如50：1，100：1，可得大量拷贝的ssDNA用于测序6.GC串PCR(GCclampPCR)应用变性剂梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可检测出DNA片段中一对碱基的变化，在DNA分子一端加上一GC串（约40n.t.）利用它的高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内的点突变第40页，课件共53页，创作于2023年2月

7.竞争引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)

有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。第41页，课件共53页，创作于2023年2月8.等位基因专一PCR(AllelespecificPCR,ASPCR)

该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。9.反转PCR(inverserarinvertedPCR)

该法可用于扩增已知序列两侧的未知序列第42页，课件共53页，创作于2023年2月10.反向PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNA的PCR扩增

第43页，课件共53页，创作于2023年2月

11.加端PCR(Add-onPCR)

在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列

12.错