圆二色谱仪课件

2023/8/3CD/ORD发展历史

1961

CaryModel60Spectropolarimeter,JascoAP-11963

JascoORD/UV51960

-1965Jobin-YvonCDCary61CDJascoORD/UV5-CD1969

Cary1401CD1970

JascoJ-201972

JascoJ-40CD/ORD1978

JascoJ-500

1980J-2001983

Bio-Logic4001986J-6001990

JascoJ-700CD,Jabin-YvonCD6,AVIV410(Cary60)1999

JascoJ-810Bio-LogicMOS-4502003

APPChiraScan2005

JascoJ-8152006

APPChiraScanPlus2007

AVIVModel4202013

newBio-LogicMOS-500newJascoJ-1500

2023/7/27CD/ORD发展历史1961Cary2023/8/32023/7/272023/8/32023/7/272023/8/3圆二色CircularDichroism对左旋和右旋圆偏光的吸收不同，形成椭圆偏振光2023/7/27圆二色CircularDichrois2023/8/32023/7/272023/8/3α-螺旋

α-Helix

β-折叠β-Sheetβ-转角β-Turnpoly(Pro)II无规则卷曲Random2023/7/27α-螺旋α-Helixβ-折叠β-S2023/8/3-band(nm)+band(nm)α-螺旋

α-Helix

222，208192β-折叠β-Sheet216195β-转角β-Turn220-230(弱)180-190(强)205左手螺旋P2结构poly(Pro)II190210-230(弱)无规则卷曲Random2002122023/7/27-band(nm)+band(nm)α2023/8/3α-Helixβ-SheetTurnRandomα-helix:41%

β-Sheet:15%

Turn:23%

Random:21%2023/7/27α-Helixβ-SheetTurnRan2023/8/3蛋白质近紫外CD表征三级结构信息蛋白质中芳香氨基酸残基,如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区260～320nm，表现出CD信号。研究表明：色氨酸在290及305nm处有精细的特征CD峰；酪氨酸在275nm及282nm有CD峰；苯丙氨酸在255、260及270nm有弱尖锐的峰2023/7/27蛋白质近紫外CD表征三级结构信息2023/8/32023/7/272023/8/32023/7/272023/8/32023/7/272023/8/32023/7/272023/8/32023/7/272023/8/3Bio-LogicMOS-500JascoJ1500APLChirascan2023/7/27Bio-LogicMOS-500Jasc2023/8/32023/8/3Bio-LogicMOS-500JascoJ-1500光源150W150W2023/7/272023/7/27Bio-LogicMO圆二色谱仪课件2023/8/3光柵-稜鏡就色散而言，光栅的性能较优于棱镜第一，由分辨本领知，光栅可经由增加光栅数或观察光栅的高级谱线(较大之p值)来增大其分辨本领；而棱镜只有增大棱镜一个方法来增大，这是光栅优于棱镜的一点。第二，用棱镜分光时，因为色散是和波长的三次方成反比，所以实际上所看到的相同波长间隔的光谱区域并不相等，而是长波长的光谱区域较短，短波长的光谱区域较长。用光栅分光时，因为光栅方程式示出绕射角与入射光的波长成正比，所以，所看到的相同波长间隔的光谱区域大致相等，这是光栅优于棱镜的第二点。第三，就光谱而言，对于宽度相同的入射缝，光栅形成的谱线较明亮，易于观察。根据上面从色散的观点所讨论知道，光栅在这方面较优于棱镜，而这也是光栅分光仪较常被使用的原因。2023/7/27光柵-稜鏡就色散而言，光栅的性能较优于棱镜2023/8/32023/8/3-operationinNIRcallsforverynarrowslits-largebandpassesarenotpossibleinthelowUVsinceslitwidthismechanicallylimitedto2or3mmJascoJ-800tokeepconstant1nmbandwidth*,followingslitwidthsλ(nm)slitwidth(mm)

9000.0118000.0137000.019600

0.027500

0.053400

0.1043000.2782500.538200

1.344170

2.770狭缝宽度Bio-LogicMOS-500tokeepconstant1nmbandwidthSlitwidthalways2mm,from163nmto1250nm2023/7/272023/7/27-operationi2023/8/3JascoCD狭缝校准2023/7/27JascoCD狭缝校准2023/8/3JascoCD波长校准2023/7/27JascoCD波长校准2023/8/3JascoCD圆二色椭圆度校准2023/7/27JascoCD圆二色椭圆度校准2023/8/3光源:

三种光源

(Xe/Hg-Xe/钨丝灯)设计Xe光谱扫描用(130…175W),W波长500nm以上用,Hg-Xe停流或变温检测用Bio-LogicMOS-500JascoCD单光源设计2023/7/27光源:三种光源(Xe/Hg-Xe2023/8/32023/7/272023/8/3氮气吹扫Bio-LogicMOS-500185nm以下3升/min.

185nm以上不需氮气吹扫

Jasco&APLCD3-10L/min2023/7/27氮气吹扫Jasco&APLCD溶剂内含物建议清洗方法水溶液蛋白质DNA生物制剂含洗涤剂温水浸泡、稀酸润冲再大量纯水冲洗。水溶液盐溶液温水、酸清洗、大量水依次冲洗。水溶液碱性溶液含洗涤剂温水浸泡、稀酸、大量水依次冲洗。有机溶液油性基质溶剂，含洗涤剂温水，稀酸清洗，大量水冲洗有机溶液酒精溶液溶剂清洗，大量水依次冲洗有机溶液酸性溶液溶剂清洗，大量水依次冲洗有机溶液碱性溶液溶剂，稀酸清洗，大量水依次冲洗比色池清洗建议1如何清洗比色池:需要确定比色池上污染物类型。下表中列出了一些清洗建议：荧光测量：使用5M硝酸清洗比色池，使用前用大量水冲洗。稀酸：2M稀盐酸或2M稀硝酸,酸：5M盐酸或5M硝酸,溶剂清洗：使用对样品溶解力最强的溶液清洗大量水清洗：使用至少10倍的纯水（包括去离子水，蒸馏水或RO）清洗清洁剂：如果可以使用中性清洁剂，使用后，用稀酸，大量水将清洁剂清洁干净溶剂内含物建议清洗方法水溶液蛋白质DNA生物制剂含洗涤剂2注意事项：保持比色池清洁干净是比色池可长时间有效使用的最重要因素之一。日常工作时，永远不可以令比色池处于干燥状态。在使用间隔期间，如将比色池置于水或有机溶液中，比色池就不会变干或者粘附。只可以使用镜头清洁纸或细布擦拭光学配件表面，大多数的纸制品都含有木纤维，会刮伤会损坏比色池界面或表面。日常工作结束以后，一定要将比色池清洗干净，变干后放置在合适的容器中。2注意事项：保持比色池清洁干净是比色池可长时间有效使用的最3特殊情况5M硝酸：不可以用于清洗具有抗反射或具有镜面涂层的比色池超声波清洗器：不建议使用超声波清洗器清洁比色池。每个清洗器都有不同的频率，如果清洗器同比色池产生共振，就会毁坏比色池。3特殊情况5M硝酸：不可以用于清洗具有抗反射或具有镜面涂层CD(圆二色光谱仪)样品的前处理在测量CD以前先测量一般UV/VIS吸收光谱。CD光谱的需求与UV/VIS一样：在0.5-1.0吸收值范围内的讯号会有最好讯杂比。通常样品与溶剂吸收值和大于2O.D.时将会很困难得到正确的数据。实际上在低波长UV扫描很困难得到正确吸收值。大部份现今光谱仪都限制在190nm以上，因此任何一次低于200nm以下测定将会是个问题。所以通常会建议直接使用CD光谱仪来做吸收光谱测量。

CD(圆二色光谱仪)样品的前处理在测量CD以前先测量一般UV选择合适的缓冲液在CD测定时选择合适的缓冲液是非常重要。缓冲液必需尽量「透明」。大部份有意思的结构信息被发现在低波长UV。这个波段也是一些缓冲液具有高吸收值会遮蔽CD讯号。对大部分工作而言10mM磷酸钾是一个很好的选择。我们可以用适当比例的KH2PO4及K2HPO4混合达到我们想要的pH值。千万不可以用HCl来调整pH。在低UV波段氯离子会严重干扰CD测定。如果有需要辅助离子时不要使用NaCl，可以用Na2SO4或NaF。

选择合适的缓冲液在CD测定时选择合适的缓冲液是非常重要。缓冲比色池光径

选择合适光径的CD比色池对于解决溶剂吸收问题将会非常有帮助。小一点光径(如：0.1mm或0.05mm)液槽可以明显降低溶剂吸收并且可容许扫瞄到低波长。而这些液槽必需使用较高浓度的蛋白质，如约1mg/ml。比色池光径

选择合适光径的CD比色池对于解决溶剂吸收问题将会2023/8/3CDTypicalConditionsforproteinCDProteinConcentration:0.1mg/ml

(or1mg/ml)CellPathLength:1mm(0.1mm)Volume200μl(20μl)Needverylittlesample0.02mg(0.02mg)BufferConcentration:5mMaslowaspossibleSacnspeed:30nm/min.Bandwidth:1nmBio-LogicMOS-5002023/7/27CDTypicalConditions2023/8/32023/8/32023/8/3MOS-500Cuvette:1mmquartzcuvette.Chemicalused:Henegglysosyme:0.1and0.2mg/mlinwater.Bandwidth:2nmSacnspeed:30nm/min.CD2023/7/272023/7/272023/7/27MOSCuvette英国Starna圆二色光谱仪专用比色池圆二色光谱测量时用长方形比色池即可,测量旋光色散谱时采用圆形比色池为佳但也可使用方形比色池Cuvette英国Starna圆二色光谱仪专用比色池圆二色光TypeNo.材质光径mm内部宽度mm外部尺寸mm容积Vol.ml长宽高1or21Q,I,1103.512.5450.400/0.2751Q,I,2104.512.5450.700/0.451Q,I,5107.512.5451.700/1.21Q,I,101012.512.5453.500/2.5英国Starna圆二色光谱仪专用比色池Type材质光径内部宽度外部尺寸mm容积长宽高1or21QTypeNo.材质光径mm内径mm外部mm体积Vol.ml直径长度31/BQ0.01132222.50.14031/BQ0.05132222.50.15131/BQ0.10132222.50.16531/BQ0.20132222.50.19431/BQ0.50132222.50.27831/BQ1132222.50.42031/BQ2132222.50.70331/BQ5132222.51.552英国Starna圆二色光谱仪专用比色池Type材质光径内径外部mm体积直径长度31/BQ0.011TypeNo.材质光径mm样品仓mm外部尺寸mm容积Vol.ml宽长高宽长高20/CQ,I0.0180.013812.52.5450.00320/CQ,I0.0880.083812.52.5450.02420/CQ,I0.180.13812.52.6450.03020/CQ,I0.280.23812.52.7450.06020/CQ,I0.580.53812.53.0450.15020/CQ,I1813812.53.5450.310英国Starna圆二色光谱仪专用比色池可拆卸式比色池,光程最短可至0.01mm,样品只需3uLType材质光径样品仓mm外部尺寸mm容积宽长高宽长高20/TypeNo.材质光径mm外部尺寸mm容积mlRemarks宽长高3/MS

Q1012.512.5453.5标准荧光池9-F/MSQ1012.512.5451.8半微量荧光池18-F/MSQ1012.512.5450.9微量荧光池23-F/MSQ1012.512.5483.5标准荧光池，带密封塞29-F/MSQ1012.512.5481.8半微量荧光池，带密封塞28-F/MSQ1012.512.5480.9微量荧光池，带密封塞英国Starna圆二色光谱仪专用比色池变温实验用搅拌池Type材质光径外部尺寸mm容积Remarks宽长高3/MSSolventUseableshortwavelengthLimit(nm)Remarks1cmcell1mmcell0.1mmcelln-hexane~210~183~180Nonpolar,smallsolubilityCyclohexane~210~185~180Nonpolar,smallsolubilityIsooctane~210~185~180Nonpolar,smallsolubilityDioxane~220~210~202Nonpolar,commonlyusedfororganiccmpoundsBenzene~280~275~270Nonpolar,sometimesusedinthemeasurementofsymtheticpolymersCarbontetrachloride~250~240~230Nonpolar,specialinOERCDChloroform~240~230~220Intermediatepolarity,usedincomperisoneithNMRdata1,2-dichloroethane~220~210~200Nonpolar,highsolubilityMethanol~210~195~185Polar,commonlyusedfororganiccompoundsEthanol~210~195~185Polar,frequentlyusedfororganiccompoundsTrifluoroaceticacid~260~250~240Measurementofsyntheticpolymers,corrosiveDimethylsulfoxide~264~252~245UsedinthemeasurementofsyntheticpolymersTetrahydrofuran~220~210~204Usedinthemeasurementofsyntheticpolymerst-decalin~220Solventforhightemperaturemeasurement(bp+194.6℃)不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表SolventUseableshortwavelengtSolventUsableshortwavelengthlimit(nm)1cmcell1mmcell0.1mmcellEthanol/methanol(4:1)~210nm~200nmDistilledwater~185nm~180nm~175nm10mMSodiumphosphate~182nm0.1MSodiumphosphate~190nm0.1MSodiumchloride~195nm0.1Mtris-HCl~200nm0.1MAmmoniumcitrate~220nm不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表SolventUsableshortwavelengthSolventShort-wavelengthlimit(nm)Path-lengthofcell1mm0.2mm0.1mm0.05mmDistilledwater180nm176nm175nm174nmHeavywater(forNMR,99.75%)175nm172nm171nm170nmn-Hexane(forfluorescence)172nm169nm168nmTrifluoroethano;(forNMR,99.5%)177nm170nm不同溶剂在不同光程比色池的截止波长表SolventShort-wavelengthlimit(2023/8/3HowtoSelectParameters波长测量范围选择:先用圆二色光谱仪测量来测量待测样品的紫外光谱,圆二色光谱的波长检测范围可设在有紫外吸收波段两端再各加50-100nm2023/7/27HowtoSelectParamet2023/8/3Dataacquisitionintervals(resolution)Inspectrummeasurement

Usually,about0.2nmwilldo.

However,ifthescanningspeedissetat

[Step],about1nmisappropriate.Maketheresolutioncoarseifspectrumpeaksarebroadorfineifsharp.2023/7/27Dataacquisitioninte2023/8/3Thescanningspeedmustbechangedaccordingtoresponse.Usually,setthescanningspeedat20to100nm/minandresponseat0.25to2secinmeasurement.Scanningspeed(nm/min)Response(recommended)Higherlimit100001.0to2.0msec32.0msec50002.0to4.0msec64.0msec20004.0to8.0msec0.25sec100032.0msecto0.125sec0.5sec50064.0msecto0.25sec1.0sec2000.125to0.5sec2.0sec1000.25to1.0sec4.0sec500.5to2.0sec8.0sec201.0to2.0sec16.0sec102.0to4.0sec16.0sec52.0to8.0sec16.0sec24.0to16.0sec16.0sec18.0to16.0sec16.0sec扫描速度Scanningspeed2023/7/27Thescannin