临床微生物检验与临床

临床微生物检验

与临床机遇与挑战并存感染病因的复杂免疫力低下的人群急剧上升全民关注感染问题相关部门的重视未知病原的鉴定临床要求有效时间内的有效报告细菌检验人员技术面和设备不能满足临床要求信任危机现代感染的特点新感染性疾病:SARS、禽流感、猪流感已被征服的疾病卷土重来：结核、性病、炭疽低免疫人群急剧上升：艾滋病、移植患者动物微生物向人类的袭击细菌耐药、经验性用药失败、细菌培养阳性率低、细菌报告至少3天，离8h出报告相差很远思考我们应如何面对挑战？微生物学发展中的大事件迷茫时代很早以前中国人就知道了有些疾病可以传染，但认为是由不可见的“神”或“鬼”引起古埃及、古印度也有同样的传说到我国明代李时珍的《本草纲目》中就有了将病人穿过的衣服蒸过以后再穿就不会传染疾病的记载

直到17世纪后期发明了显微镜后才真正观察到了微生物的存在

显微镜问世揭开了微生物检验的序幕

1676年荷兰人虎克创制了一台能放大200-300倍的显微镜，发现了许多肉眼看不见的微小生物，并正确地描述了微生物的形态有球形、杆状、螺旋体等，为微生物的存在提供了证据微生物学发展中的大事件

巴士德开创造了微生物的生理学时期

直到19世纪60年代，法国科学家巴士德发明了加温处理物品的巴氏消毒法，证明了有机物的发酵和腐败是微生物作用的结果，开始了微生物的生理学时期，人们认识到不同微生物间不仅有形态学上的差异，在生理学特性上亦有所不同虎克发现了微生物的存在，但缺乏基本的认识和技术，微生物的研究仍长期停滞，经历了近200年的漫长过程微生物学发展中的大事件

李斯特开创了预防院内感染的新纪元

在巴斯德研究结果的启迪下，英国外科医生李斯特（JosephLister）用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具，创建了无菌外科手术，成为微生物学应用于医学实践的一个巨大成就，开创了预防院内感染的新纪元微生物学发展中的大事件

微生物学创立及发展

德国医生郭霍创用了固体培养基分离细菌和细菌染色法，使他和巴士德一道成为实验微生物学的奠基人，并提出了著名的郭霍法则此后，微生物学才真正创立并极大的发展自郭霍法则提出后20年是细菌学发展的黄金时代，相继分离出炭疽杆菌，结核杆菌，霍乱弧菌，白喉杆菌，伤寒杆菌，脑膜炎球菌，破伤风杆菌，鼠疫杆菌，痢疾杆菌等微生物学发展中的大事件

病毒的发现

1892年俄国科学家伊凡洛夫斯基发现了一种可通过细菌滤器的最微小生物-病毒

微生物学发展中的大事件

磺胺的发现

1907年Gelmo在研究偶氮染料时制成了氨苯磺胺（最初时作为一种红色的染料），1935年杜玛克（domagk）将磺胺应用于医学，1936年用于临床，当时主要是治疗A组β-溶血性链球菌所致的产褥热，使病死率显著下降，于1939年荣获诺贝尔医学奖微生物学发展中的大事件

青霉素的发现1929年Fleming发现青霉素并随后由Florey和Chain用于临床（1939年分离提纯成功、1942年用于临床）并取得惊人的效果，于1945年三人共同荣获诺贝尔医学奖微生物学发展中的大事件二战时的一张张贴画，标志着抗生素时代的到来微生物学发展中的大事件

抗生素的发现

1944年Waksman自灰链霉菌培养中分离出可拮抗结核杆菌的链霉素，于1952年荣获诺贝尔医学奖1947年发明氯霉素1947年发现多粘菌素1948年发现金霉素1949年发现新霉素

1950年发现土霉素。。。微生物学发展中的大事件1943年青霉素大规模使用，1945年院内感染的20%金黄色葡球菌对其产生抗性1947年链霉菌素上市，同年该药耐药菌出现1952年四环菌素上市，1956年其耐药菌出现1959年甲氧西林上市，1961年其耐药菌出现

细菌耐药性第一次提到了重要的日程抗生素使用与细菌耐药变化1964年头孢噻吩上市，1966年其耐药菌出现1967年庆大霉素上市，1970年其耐药菌出现1981年头孢噻肟上市，1983年其耐药菌出现1996年，发现万古霉素耐药菌2001年利奈唑胺上市，2002年其耐药菌出现抗生素使用与细菌耐药变化逐步上升到用20万、100万、400万、以及更高单位才能控制，甚至对青霉素产生耐药性随着抗生素特别是二代与三代头孢菌素的广泛使用，导致了多重耐药菌的不断增多并迅速扩散，它对许多抗生素产生耐药性1943年用2万单位青霉素就能够控制的感染

细菌耐药性问题再次被提到了重要的日程抗生素使用与细菌耐药变化这些耐药菌、尤其是多重耐药及泛耐药菌，已经成为目前临床医生难以对付的“超级细菌”抗生素使用与细菌耐药变化早在抗生素应用以前有些细菌就具有抗药基因早在人工合成的抗生素使用之前，细菌就与自然界中的一些天然抗菌成分以及其他微生物产生的抗菌物质广泛接触而获得了耐药基因.（如放线菌代谢产物、天然植物、中草药等）抗生素使用与细菌耐药变化细菌耐药属于一种自然现象，是微生物进化的结果细菌的抗药性也是进化选择的结果，抗生素的滥用加剧了细菌耐药性的产生细菌在生长繁殖过程中会产生耐药性基因的突变，在使用抗生素的选择压力下，耐药性细菌被筛选出来并优势繁殖抗生素使用与细菌耐药变化细菌耐药已成为21世纪全球关注的热点对人类生命健康所构成的威胁绝不亚于艾滋病，癌症和心血管疾病防止滥用抗生素而造成耐药菌的出现及快速传播、不断研究开发新的抗菌药物是战胜细菌耐药的重要途径抗生素使用与细菌耐药变化抗菌药物临床应用管理办法第三章抗菌药物临床应用管理第十六条

……三级医院抗菌药物品种不得超过50种；二级医院不得超过35种，同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成类同的复方制剂1-2种。具有相似或相同药学特征的药品不得重复采购。第二十八条……医疗机构住院患者抗菌药物使用率不得超过50%……门诊抗菌药物处方比例不得超过15%。抗菌药物临床应用管理办法第三章抗菌药物临床应用管理第二十九条二级以上医院应当开展细菌耐药监测工作，定期发布细菌耐药信息，建立细菌耐药预警机制，针对不同的细菌耐药水平，采取不同应对措施。对接受抗菌药物治疗的患者中，微生物检验样本送检率不得低于30%。（一）对主要目标细菌耐药率超过30%的抗菌药物，应及时将预警信息通报本机构医务人员。（二）对主要目标细菌耐药率超过40%的抗菌药物，应慎重经验用药。（三）对主要目标细菌耐药率超过50%的抗菌药物，应参照药敏试验结果选用。（四）对主要目标细菌耐药率超过75%的抗菌药物，应暂停该类抗菌药物的临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复其临床应用。入选前抗生素使用情况对致病菌分离率的影响P<0.05标本采集部位非无菌部位无菌部位眼血液耳骨髓呼吸道脑脊液肠胃道胸水泌尿道腹水皮肤关节液毛发痰（Sputum）痰液通常作为下呼吸道细菌感染的标本。痰液是一个由支气管分泌物和炎性渗出物组成的混合物，通过口腔咳出。不管是采集合适的标本，还是解释培养出的结果都存在难点。因为繁忙和技术不够熟练或未接受培训的人员可能会错误的采集和送检唾液到实验室。通常需要反复送检痰培养，来确认真正的致病株。标本质量带血痰唾液or诱导痰(?)脓痰粘液样痰结果分析发现问题，怎么办？阳性率低？采样部位；采样操作；运送方式及时间；培养环境；在新形势下

重新审视血培养明确血培养的临床意义血培养对以下疾病很重要—菌血症—感染性心内膜炎

—临床不明原因感染

—假体植入后感染（人工关节、人工瓣膜）

—静脉导管相关性菌血症

—肺炎血培养是最好的工具帮助他们用药、减少死亡

指示预后健康人能在几分钟内将血中菌消失病人则不能将病原菌控制在原发部位医生未能将病原菌，如：—清除失败

—引流不成功死亡率与病原菌、药敏谱、基础病相关，亦即提供了预后信息败血症由感染引起的全身感染发病率上升、在致死的主导因素中居第十位非冠脉意外的ICU中最多见的致死因素器官功能障碍的常见诱因不同部位感染败血症发生率感染情况发病数：美国和欧洲80万/年败血症休克：40万/年死亡人数：20万/年北京协和医院：病死率38.4%,院内感染病死44.6%当前血培养存在的问题采样时污染严重培养一次阴性作为诊断依据血液与培养基比例不正确采样时间不正确少做厌氧培养不能及时报告国际上仍然公认血培养是诊断血流感染的金标准！采血指针发热（>38。C）或低温（<36。C）寒战白细胞增多皮肤黏膜出血昏迷多器官衰竭，血压降低，CRP升高及呼吸快特殊患者出现粒细胞减少，血小板减少等皮肤消毒程序

70%酒精

1%~2%碘酊30秒或者10%碘伏消毒60秒70%酒精脱碘皮肤和环境的细菌在严格的消毒条件下，仍有3%~5%的污染菌”：皮肤菌表皮葡萄球菌座疮丙酸杆菌梭杆菌属类白喉群环境菌：革兰阳性杆菌、不动杆菌皮肤和环境的细菌何种情况下考虑可能是菌血症的致病菌？对两次不同部位血培养生长同一种微生物其他无菌部位标本培养中生长同一种微生物微生物快速生长<=48小时实验室工作人员和医生之间进行交流沟通，结合临床讨论这些菌意义静脉穿刺和培养接种程序

在穿刺或穿刺期间，不可接触穿刺点

用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头，直接注入血培养瓶血标本接种培养瓶后，轻轻混匀以防止血液凝固，立即送检血培养次数病特点

阳性率1套1+2套1+2+3套一般菌血症65%80%96%感染性心内膜炎80%2004年报告：163位病人，血培养仪血培养次数怀疑菌血症的成人患者：采集2~3套血培养标本（不同部位）婴幼儿患者：采集两次血培养标本（不同部位）除特殊情况外，在采集血培养后的2~3天内，无需重复采集血培养可疑持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关血流感染，间隔（1~24h）几次取血检测、捕捉、指导治疗实验室类型: 美国私立大医院微生物实验室

医院病床数: 800beds

微生物标本量: 600个标本/天

血培养标本量: 150瓶/天

血培养标准采样: 3套瓶/24小时(1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套)

阳性结果: 10-30株需氧或兼性厌氧菌/天,2株厌氧菌/月

BacT/ALERT3D240 7台

实验室类型: 美国大型独立实验室

标本来源: 14家中型医院和一些小诊所

微生物标本量: 8000个标本/天

血培养标本量: 1400瓶/天

阳性结果: 75-100个阳性结果/天

BacT/ALERT3D240 30台(5列,每列6台)中国某三甲医院

微生物送检标本分布（3200床位）

（40,000标本/年）香港大学玛丽医院微生物科工作人员医师4人技术员30余人文秘和工人约30人每天接受标本约800份血培养200~300份痰培养100份

………..工作制度（24小时值班制度）白天每隔半小时核对、接种新到的标本夜间则延长至1小时国内外血培养频率1000张床位医院名称每天血液培养瓶北京协和医院60-100美国马里兰州某医院200-350菌血症病原菌种类构成需氧瓶厌氧瓶需氧菌兼性厌氧菌厌氧菌病原菌培养更完整厌氧血培养瓶的作用不仅培养厌氧菌可帮助提高兼性厌氧菌的阳性率血液在需氧瓶和厌氧瓶中分配建议常规情况下，一份血培养应包括：1个需氧瓶和1个厌氧瓶（1次穿刺）当采血量不能满足推荐的采血量时，应首先满足需氧瓶的需要。注意：对于仅用需氧瓶的实验室来讲，每次采血必须注入2个需氧瓶中以确保足够量的采血量。采血时机细菌通常在寒战和发烧前1小时入血，此时为采血培养标本进行病原培养的最佳时机在考虑使用抗菌药物之前。立即采集血培养标本建议同时或间隔短时间内采集2套以上血培养标本血培养的采集部位从静脉取血不宜从静脉导管或静脉留置口取血如必须从留置导管内采血，应同时从外周静脉采集另一个血培养标本，以帮助阳性结果判读尽快送检做血培养的患者多数病情危急，采血后应立即送检，如不能立即送检，需室温保存或置35。C孵箱中，切勿冷藏全自动血培养系统连续振荡孵育和检测同时进行，每10分钟检测一次，可及时发现阳性结果并报告无须盲传，减少了血培养污染机会2天内可报告90%以上的阳性结果培养基添加多种促细菌生长因子，适合各种细菌的生长可进行需氧菌、厌氧菌的培养，也可进行结核菌培养血培养结果报告紧急处理和优先原则建议在有条件的医院，通过医院信息系统，让临床医生随时掌握血培养检测的进展情况，包括血培养已开单，但未收到血培养已收到24小时无细菌生长48小时无细菌生长检测中，尚无结果有菌生长，分离培养和药敏进行中阳性培养结果（细菌鉴定和药敏试验的最终结果）加强与临床科室的联系要主动配合、加强交流、增进了解、互相协作、必要时参加相关科室感染病例的会诊，讨论有关诊治方面的问题，提出有效方案，尤其对检出细菌的种类和耐药情况作出说明，提出防止耐药性和医院感染的警报和措施。Case1男，98岁，入院诊断：AECOPD肺炎？发烧：39.4度，X光检查：右肺肺炎WBC:17.8X109/L,中性粒细胞88%Case1经验用药及培养结果亚胺培南、替考拉宁、氟康唑，用药24h后，症状无改变。痰培养：铜绿假单胞菌（++）、鲍曼不动杆菌（+）肺泡灌洗液培养：铜绿假单胞菌入院3h做血培养：6h系统提示阳性，涂片结果：革兰阴性杆菌Case1经验用药及培养结果入院24h血培养初步药敏报告：亚胺培南R头孢他啶R

环丙沙星R派拉西林/三唑巴坦R

头孢哌酮/舒巴坦ICase1入院24h后改变治疗头孢派酮/舒巴坦代替亚胺培南入院后48h正式鉴定和药敏报告铜绿假单胞亚胺培南R美罗培南R头孢他啶R派拉西林/三唑巴坦R

环丙沙星R头孢哌酮/舒巴坦I

氨曲南S专家提示系统:可能是产金属酶的细菌，对碳青霉烯类天然耐药，氨曲南可逃离金属酶的水解Case148h改变治疗48h改变治疗：氨曲南+妥布霉素56h症状明显改善48h、54h血培养：无菌生长，7天后痊愈出院Case1启示经验性抗菌治疗带来的不良后果细菌耐药机制的检测，有助于合理使用抗生素快速准确的鉴定有助于医院感染的控制阳性率的影响因素原理上，

常规致病菌只要有1个活菌落入培养瓶内，都应该可以在几天内被增殖到106～7（仪器报告阳性）细菌以简单的二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度极快。细菌分裂倍增的必须时间，称为代时，细菌的代时决定于细菌的种类又受环境条件的影响，细菌代时一般为20～30分钟，个别菌较慢，如结核杆菌代时为18～20小时，梅素螺旋体为33个小时。大肠杆菌的代时为20分钟，以此计算，在最佳条件下8小时后，1个细胞可繁殖到200万上（2*106），10小时后可超过10亿，24小时后，细菌繁殖的数量可庞大到难以计数据和程度。但实际上，由于细菌繁殖中营养物质的消耗，毒性产物的积聚及环境pH的改变，细菌绝不可能始终保持原速度无限增殖，经过一定时间后，细菌活跃增殖的速度逐渐减慢，死亡细菌逐增、活菌率逐减。有临床意义的分离株

BourbeauPPetal.RoutineincubationofBacT/ALERTFAandFNbloodculturebottlesformorethan3daysmaynotbenecessary.

JClinMicrobiol.2005;43:2506-2509结果表明培养的前三天，有临床意义分离株的97%被检出，培养前两天的检出率为94%。97％Update……Low-levelbacteremia(=<10CFU/ml)maybemorecommoninpediatricpatients

thanhasbeenpreviouslythoughtandhasbeenreportedinupto38%ofculture-positivechildren,aspreviouslyreviewed(20).

如前所述，低浓度菌血症（=<10CFU/ml）占培养阳性的儿童患者比例已经达到38％，并可能比以往设想的更加多见……应重新审视厌氧瓶的作用增加采血量增加兼性厌氧菌的分离机会增加厌氧菌的分离机会提升阳性率！AnaerobicBloodCultures

UsefulintheICU?Despitetheseobservations,thereisunwillingnessinthemedicalcommunitytoalterthecurrentpracticeofobtaininganaerobicbloodcultures.Themostcompellingreasonforthisreluctanceisthatmostclinicallysignificantaerobicbacterialpathogensarefacultativeanaerobes.Continuingthepracticeofobtainingbothaerobicandanaerobicbloodcultures,therefore,ineffectdoublesthevolumeofbloodculturedandmay,thereby,increasetheisolationofthesefacultativeorganisms.

Moreover,therearesomepathogenicorganismsthatareclassifiedasfacultativeanaerobesthatgrowmorequicklyinanaerobicconditions.Thus,bloodculturesfortheseorganismsmaybepositiveearlieroronlypositiveintheanaerobicbloodculturebottle.RylandP.Byrd,Jr,MD,FCCPThomasM.Roy