第4章-菌种保藏课件

第四章菌种保藏关海燕生命科学技术学院nghaiyan1@126.com目录1.菌种的退化2.菌种的保藏3.菌种的复壮一菌种的退化（一）菌种退化现象

生产菌株生产性状的劣化或遗传研究菌株遗传标记的丢失均称为菌种退化。菌种退化涉及微生物的形态和生理等多方面的变化。例如产生孢子能力的丧失，发酵液中产物组成改变，主产物减少和副产物增加等。（二）菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。是不可避免的，而减缓速度则是可能的。变异速度与菌种所处的环境有密切的关系，不良环境条件能促进变异，频繁或过多传代也是造成衰退变异的重要原因。为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，这就是菌种保藏与复壮工作。（三）防止菌种退化的措施

1．控制传代次数

2．创造良好的培养条件

3．利用不同类型的细胞进行移种传代

4．采用有效的菌种保藏方法

（一）目的使菌种不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间二菌种保藏

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时考虑该方法的经济适用性。

（二）菌种保藏的原理

保藏的一般程序是先选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，然后创造其最有利于休眠的环境条件，降低菌种代谢活动的速度，以达到长期保存的目的。低温干燥无氧缺营养不利

条件

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。

1.斜面低温保藏法

将菌株接种于合适斜面培养基上，待生长好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间（细菌，1个月；放线菌，3个月；酵母菌，3-6个月；丝状真菌，4个月）进行移接培养后再将新斜面继续保藏。（三）菌种保藏的方法

这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌种客易产生变异。2.液体石蜡封藏法

将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达1年以上。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。

石蜡油管的转接和搬运都很不方便。3.砂土管保藏法

将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽孢的细菌和酵母菌。此法保存期可达1年以上。

主要包括砂土制备和真空抽干两步。

（1）砂土制备砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3:2或1:1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，按比例混合后，装入小试管内，装料高度约为lcm左右，经间歇灭菌2-3次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备用。

（2）真空抽干将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合；或用无菌水（3-5ml）洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合（0.2-0.3ml）。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。

4.真空冷冻干燥法

原理：在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，因而能长期保存，一般为5~10年。

微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。

该法存活率高，变异率低，并能广泛适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是目前广泛采用的好方法。其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。5.超低温冰箱保藏法

由于现在超低温冰箱的使用已较普及，所以菌种的超低温保藏法在生产企业和研究机构已得到广泛应用。该方法的要点是：将要保藏的菌种置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于试管或安瓿管内，然后将其放入超低温冰箱中于-70℃下保藏。该法简便易行，而且保藏效果较好。6.液氮超低温保藏法

微生物在-130℃的低温下，所有的新陈代谢活动暂时停止而生命延续，这种环境下可永久性保存微生物菌种。液氮的温度可达-196℃，保存微生物菌种已获得满意的结果。

液氮超低温保藏法简便易行，关键是要有液氮存储装置。

该方法要点是：将要保存的菌种（菌液或长有菌体的琼脂块），置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于安瓿管内（安瓿管的玻璃要能承受很大温差而不致破裂），先将菌液降至0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降至-35℃，然后将安瓿管放入液氮中（液相或气相均可，前者-196℃，后者-150℃）。

保藏的菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取出，立即置于38-40℃温水浴中，振荡，直到全部融化为止，开启移种。液氮保藏法在实际应用中尚存在一些问题，如需要经常补充液氮，保藏菌种的管理费用高，菌种的取出也不如冻干管方便。但这种方法可用微生物的多种培养材料进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养或固体培养、菌落或斜面均可。此法是目前最可靠的移种长期保存菌种的方法。

7.固体曲保藏法（麸皮保藏法）

适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体(孢子)后加以保存。

将要保存的菌种制成孢子悬浮液，取适量加入已灭菌的大米培养基中，敲散拌匀，铺成斜面状，在一定温度下培养，在培养过程中要注意翻动，待孢子成熟后，取出置冰箱保存，或抽真空至水分含量在10％以下，放在盛有干燥剂的密封容器中低温或室温保存。保存期1～3年。8.基因工程菌的保藏

基因工程菌由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。

另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。

当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。

由此基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。

例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA输入E.coli细胞外，还赋予E.coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效

1.我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM),它的任务是促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展,以便更好地利用微生物资源为我国经济建设、科学研究和教学服务。该委员会下设7个菌种保藏管理中心,其负责单位、代号及保藏菌种的性质各有不同。

（四）菌种保藏机构（1）中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院)

中国科学院微生物研究所(AS)

中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV)

（2）中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院)

中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF)

（3）中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会)

中国食品发酵工业研究所(IFFI)

（4）中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)

中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京卫生部药品生物制品检定所(NICPBP)

中国预防医学科学院病毒研究所

（5）中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)

中国医学科学院医药生物技术研究所四川抗生素研究所(SIA)，四川华北制药厂抗生素研究所(IANP),石家庄

（6）中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部)

农业部兽药监察研究所(NCIVBP)

（7）中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院)

中国林业科学院林业研究所(RIF)2.美国典型培养物收藏中心ATCC3.美国北部开发利用研究部NRRL4.荷兰霉菌中心保藏所CBS5.英国国家典型菌种保藏所NCTC6.日本大阪发酵研究所IFO三、菌种复壮三菌种的复壮

使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；

广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。

菌种的复壮措施(一)菌种的提纯(二)通过寄主体进行复壮(三)淘汰已衰退的个体(四)遗传育种法

(一)菌种的提纯

即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。

菌种提纯方法：

一是较为粗放的方法，只要求达到菌落纯化的水平（从种的水平来说是纯的），通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，适用于菌退化不太严重的情况。

另一类方法为较精细的单细胞或单孢子分离方法。它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。要达到“细胞纯”的水平，除可采用单胞分离法，也可以二者结合（先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化）。此类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。(二)通过寄主体进行复壮

对于寄生性的退化菌株,可回接到相应寄主体上,以恢复或提高其寄生性能。例如,根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科寄主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根