华东理工大学发酵过程优化5(复习)课件

5.发酵过程控制与优化国家生化技术研究中心（上海）5.发酵过程控制与优化国家生化技术研究中心（上海）发酵的定义

狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。广义则将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。发酵的定义狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成发酵过程优化发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。除了菌种的生产性能，还与培养基的配比，原料的质量，灭菌条件、种子的质量、发酵条件和过程控制等有密切关系。因此，不论是新，老品种，都必需经过发酵研究这一关，以考查其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。发酵过程优化发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。发酵过程优化发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约，同一生产菌种和培养基配方，不同厂家的生产水平也不一定相同。这是由于各厂家的生产设备，培养基的来源，包括水质和工艺条件各不尽相同。公用系统的成本不同，会采用不同工艺。发酵过程优化发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约，同一生发酵过程优化

通常，菌种的生产性能越高，其生产条件越难满足。

高产菌种对工艺条件的波动往往比低产菌种更敏感。掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。发酵过程优化通常，菌种的生产性能越高，其生产条件越难满足微生物发酵过程培养方式微生物发酵过程可分为分批、补料-分批和半连续(发酵液带放)和连续等几种方式。不同的培养技术各有其优缺点。了解生产菌种在不同工艺条件下的细胞生长、代谢和产物合成的变化规律将有助于发酵生产的控制。微生物发酵过程培养方式微生物发酵过程可分为分批、补料-分批和分批培养（batch）分批培养（batch）分批发酵

分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。在此简单系统内所有液体的流量等于零，故由物料平衡得式5-1－5-3的微分方程：分批发酵分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了分批发酵dX/dt=

X(5-1)dS/dt=－qS

X(5-2)dP/dt=qPX(5-3)式中X为菌体浓度(g/L

);t

为培养时间(h):为比生长速率（1/h

);S为基质浓度(g/L

);-qS

为比基质消耗速率[(g/g)/h]；P为产物浓度(g/L);qP为比产物形成速率[(g/g)/h]。分批发酵dX/dt=X(5-1)分批发酵

分批发酵过程一般可粗分为4期，即停滞(适应)期、对数(指数)生长期、静止(稳定)期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期，如图5-1所示。分批发酵分批发酵过程一般可粗分为4期，即停滞(适应)分批发酵

工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，希望尽量缩短适应期。在停滞期(I),即刚接种后的一段时间内，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境有一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。分批发酵工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑，希分批发酵

加速期(Ⅱ)通常很短，大多数细胞在此期的比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。如这时菌已完全适应其周围环境，有充足的养分而又无抑制生长的物质便进入恒定的对数或指数生长期(Ⅲ)分批发酵加速期(Ⅱ)通常很短，大多数细胞在此期的比生长分批发酵

在对数生长期的比生长速率达最大，可用max表示，指数生长期的长短主要取决于培养基,包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。分批发酵在对数生长期的比生长速率达最大，可用max分批发酵

在减速期(Ⅳ)随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时比生长速率成为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍旧在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化，经短时间的减速后进入生长静止(稳定)期。分批发酵在减速期(Ⅳ)随着养分的减少，有害代谢物的积累分批发酵

减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks值)，亲和力高，即Ks值小，则减速期短。分批发酵减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks分批发酵静止期(V)，实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零，即＝

,式中为比死亡速率。此期菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化，如菌已分化，染色变浅，形成空胞等。分批发酵静止期(V)，实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生分批发酵当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期(Ⅵ)。这时

>,生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于Xo

。分批发酵当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入分批发酵

将对数期称为生长期(trophophase)。将静止期称为分化期(idiophase)。生长期末为产物的形成创造了必要的条件。分批发酵将对数期称为生长期(trophophase)。分批发酵(1)生长关联型

根据产物的形成是否与菌体生长同步关联，Pirt将产物形成动力学分为生长关联型和非生长关联型。一般，初级代谢产物的形成与生长关联；而次级代谢产物的形成与生长非直接关联。分批发酵(1)生长关联型根据产物的形成是否与菌体生长同步分批发酵qp=Yp/x

对与生长关联的产物形成，比产物形成速率随比生长速率的增长而提高。这类产物通常是微生物的分解代谢产物，如酒精。由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产生的葡萄糖异构酶也属于这一类型。分批发酵qp=Yp/x分批发酵(2)非生长关联型此类型的产物形成只与细胞的积累量有关，可用式5-9表示：dP/dt=X(5-9)式中dP/dt为产物形成速率[(g/L)/h]；

为比例常数。由此式可见，产物形成速率与菌的生长速率无关，而与菌量有关。次级代谢产物中的一些抗生素的产物合成即属于这一类。分批发酵(2)非生长关联型此类型的产物形成只与细胞的积累分批发酵分批发酵分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在浓度较低的(A~B)范围内，静止期的细胞浓度与初始基质浓度成正比，可用式5-10表达：X=Y(So－St)(5-10)式中So为初始基质浓度(g/L

);St为经培养时间t的基质浓度(g/L

)；Y为得率系数(g细胞/g基质)在A-B的区域，当生长停止时，St等于零。方程5-10可用于预测用多少初始基质便能得到相应的菌量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在浓度较低的(A~B)分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在C-D的区域，菌量不随初始基质浓度的增加而增加。这时菌的进一步生长受到积累的有害代谢物的限制。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在C-D的区域，菌量不分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响用Monod方程可描述比生长速式中max是最大比生长速率(h-1);Ks

为基质利用常数率和残留的限制性基质浓度之间的关系：＝max

S/(Ks+S)(5-11)，相当于＝max/2时的基质浓度(g/L),是菌对基质的亲和力的一种度量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响用Monod方程可描述分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中后期基质浓度下降，代谢有害物积累，已成为生长限制因素，值下降。其快慢，取决于菌对限制性基质的亲和力大小。Ks小，对的影响较小，当St接近0时，急速下降；Ks大，

随St的减小而缓慢下跌，当St接近0时，才迅速下降到零，见图5.4。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中后期基质浓度分批发酵中重要参数的变化分批发酵中重要参数的变化分批发酵的优缺点对不同对象，掌握工艺的重点也不同。对产物为细胞本身，可采用能支持最高生长量的培养条件；对产物为初级代谢物，可设法延长与产物关联的对数生长期；对次级代谢物的生产，可缩短对数生长期，延长生产(静止)期，或降低对数期的生长速率，从而使次级代谢物更早形成。分批发酵的优缺点对不同对象，掌握工艺的重点也不同。分批发酵的优缺点

分批发酵在工业生产上仍有重要地位。采用分批作业有技术和生物上的理由，即操作简单，周期短，染菌的机会减少和生产过程，产品质量易掌握。分批发酵不适用于测定其过程动力学，因使用复合培养基，不能简单地运用Monod方程来描述生长，存在基质抑制问题，出现二次生长(diauxicgrowth)现象。分批发酵的优缺点分批发酵在工业生产上仍有重要地位。采用分批分批发酵的优缺点如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在1－3天，产率较低。由于养分的耗竭，无法维持下去。据此，发展了补料-分批发酵。分批发酵的优缺点如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素补料-分批发酵

补料(流加)-分批(fed-batch)发酵是在分批发酵过程中补入新鲜料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在增加。(除取样外)

目前工厂最常用的操作模式。补料-分批发酵补料(流加)-分批(fed-batcFed-batch准稳态Fed-batch准稳态补料-分批发酵恒化器的稳态和补料-分批发酵的准稳态的主要区别在于恒化器的

是不变的，而补料-分批发酵的

是降低的。补料-分批发酵恒化器的稳态和补料-分批发酵的准稳态的主要区别补料-分批发酵

补料-分批发酵的优点在于它能在这样一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。减少初始配料体积，有利于消毒时液面控制。补料-分批发酵补料-分批发酵的优点在于它能在这样一种系统中比生长速率的最佳策略

比生长速率是过程的重要参数之一，表征生物反应器的动态特性。为了获得最大的细胞产量，应在培养期间使μ值最大。为此，应使培养基中的糖浓度保持在一最适范围。如没有现成的在线葡萄糖监控仪，可控制RQ值和乙醇浓度。比生长速率的最佳策略比生长速率是过程的重要参数之一，表分批补料的优化

为了获得最大的产率,需优化补料的策略。通过一描述比生长速率μ与比生产速率之间的关系的数学模型，藉最大原理(MaximumPrinciple)可容易获得比生长速率的最佳方案。这可以从实际分批-补料培养中改变补料的速率，如边界控制实现。分批补料的优化为了获得最大的产率,需优化补料的策略。分批补料的优化

在分批培养的前期μ应维持在其最大值，μmax,下一阶段μ应保持在μc上。这种控制策略可理解为细胞生长和产物合成的两阶段生产步骤。分批补料的优化在分批培养的前期μ应维持在其最大值，μm分批补料的优化基因工程重组干扰素高密度高表达中比生长速率的控制。对重组大肠杆菌W3110(pEC901),当μ<0.336h-1,没有乙酸生成，当μ>0.336h-1,生成乙酸而且乙酸浓度随着比生长速率增大而增大。分批补料的优化基因工程重组干扰素高密度高表达中比生长速率的控分批补料的优化

基因工程白蛋白生长相中比生长速率的控制。《重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算》生物工程学报，Vol.16No.5,2000。结合元素平衡和代谢平衡，建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型。

qgly=-0.05785-1.5184μ可通过控制甘油补料速率来有效控制μ分批补料的优化基因工程白蛋白生长相中比生长速率的控制半连续发酵

在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液(行业中称为带放)便可称为半连续发酵。半连续发酵在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵半连续发酵

带放(bleeding)是指放掉的发酵液和其它正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。半连续发酵带放(bleeding)是指放掉的发酵液和其半连续发酵这是考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。半连续发酵这是考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补充养分或前体半连续发酵应用

青霉素常用带放操作，实际上也同时将比生长速率控制在合适的数值。μ=0.012h-1

使放罐体积往往大于发酵罐体积。半连续发酵应用青霉素常用带放操作，实际上也同时将比生长半连续发酵的不足之处1)放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；2)定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；3)发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；半连续发酵的不足之处1)放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养半连续发酵的不足之处4)一些经代谢产生的前体可能丢失；5)有利于非产生菌突变株的生长。据此，在采用此工艺时必需考虑上述的技术上限制，不同的品种应具体情况具体分析。半连续发酵的不足之处4)一些经代谢产生的前体可能丢失；连续培养

连续培养是发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。连续培养连续培养是发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以连续培养

连续培养系统又称为恒化器(chemostat)，因培养物的生长速率受其周围化学环境，即受培养基的一种限制性组分控制。连续培养连续培养系统又称为恒化器(chemostat)连续培养

微生物培养的动力学特性，它在恒化器中的行为可用一些常数，μmax，Ks

，Y和Dcrit等描述。可采用的最大稀释速率受μmax值的影响；Ks值影响残留的基质浓度，从而影响菌浓与可利用的最大稀释速率；Y值也影响稳态菌体浓度。连续培养微生物培养的动力学特性，它在恒化器中的行为可用连续培养连续培养连续培养临界稀释速率Dcrit值是指x=0，即细胞被洗出系统的稀释速率，可用式5-26表示：Dcrit=μmaxS0/(Ks

+S0)(5-26)Dcrit

受常数μmax，Ks和变量S0

的影响。S0越大,Dcrit越接近μmax

。但在一简单的恒化器中不可能达到μmax值，因总是存在着基质限制条件。连续培养临界稀释速率Dcrit值是指x=0，即细胞被洗出系统连续培养连续培养连续培养连续培养连续培养应用连续培养的方法筛选耐乙酸的高产菌株在培养基中增加选择性压力，抗性菌株在培养中不断被富集连续培养应用连续培养的方法筛选耐乙酸的高产菌株多级连续培养

多级恒化器的优点是在不同级的罐内存在不同的条件。这将有利于多种碳源的利用和次级代谢物的生产。多级连续培养多级恒化器的优点是在不同级的罐内存在不同的条多级连续培养

如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷白氏菌，在第一级罐内只利用葡萄糖，在第二级罐内利用麦芽糖，菌的生长速率远比第一级小，同时形成次级代谢产物。多级连续培养如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷白多级连续培养多级连续培养连续培养中存在的问题

与分批发酵比较，连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳态后，其非生产占用的时间要少许多，故其设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定，对发酵设备以外的外围设备(如蒸汽锅炉，泵)的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。但连续发酵技术也存在一些问题，如杂菌的污染，菌种的稳定性问题。连续培养中存在的问题与分批发酵比较，连续发酵过程具有许连续培养中存在的问题对基因工程重组菌而言，连续培养的周期还与质粒稳定性有关。连续培养中存在的问题对基因工程重组菌而言，连续培养的周期还与连续培养中存在的问题

在分批培养中任何能在培养液中生长的杂菌将存活和增长。但在连续培养中杂菌能否积累取决于它在培养系统中的竞争能力。故用连续培养技术可选择性地富集一种能有效使用限制性养分的菌种。连续培养中存在的问题在分批培养中任何能在培养液中生连续培养连续培养

生产菌种突变问题

微生物细胞的遗传物质DNA在复制过程中出现差错的频率为百万分之一。尽管自然突变频率很低，一旦在连续培养系统中的生产菌中出现某一个细胞的突变，且突变的结果使这一细胞获得高速生长能力，但失去生产能力的话，它会象图5.30b中的杂菌Z那样，最终取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。生产菌种突变问题微生物细胞的遗传物质DNA在复制过生产菌种突变问题

连续培养的时间愈长，所形成的突变株数目愈多，发酵过程失败的可能性便愈大。生产菌种突变问题连续培养的时间愈长，所形成的突变株数与产物回收结合的培养

解决产物反馈阻遏的问题，理想办法是在发酵过程中产物积累时将产物及时从发酵液中分离与回收。与产物回收结合的培养

解决产物反馈阻遏的问题，理想办与产物回收结合的培养

按产物的理化性质，如分子大小、溶解度、挥发性等，运用传统的分离办法与发酵过程耦合，在克服产物抑制，提高产率上取得前所未有的成就，显示出巨大的生产潜力。与产物回收结合的培养

按产物的理化性质，如分子大小、溶膜分离与发酵的耦合

膜分离技术与发酵耦合可避免菌体丢失这一缺点，可排除有害代谢物，避免或减轻产物的反馈阻遏，从而使得细胞高密度培养成为可能，更合理的利用微生物的生产性能，以提高产率。膜分离与发酵的耦合膜分离技术与发酵耦合可避免菌体丢失这膜分离与发酵的耦合

对产物不是细胞本身的发酵来说，高密度细胞培养不一定就能获得高产率，因终产物浓度对其自身的合成是限制因素。与膜分离过程结合的生物反应器在这方面最能发挥它的特长。膜分离与发酵的耦合对产物不是细胞本身的发酵来说，膜生物反应器

根据发酵液的溶质扩散或渗透离开反应器的原理又可将第一类膜生物反应器再分为膜透析发酵和膜过滤发酵。膜生物反应器根据发酵液的溶质扩散或渗透离开反应器的原膜生物反应器

膜透析发酵是发酵液在透析膜的一侧打循环，而透析液则在膜的另一侧循环，发酵液中的代谢产物藉浓差扩散到透析液中，如图5-13a所示。膜过滤发酵是以膜作为一种过滤介质，发酵液边循环，边过滤，反应器中的体积通过补料维持,见图5-13b。膜生物反应器膜透析发酵是发酵液在透析膜的一侧打循环，而膜分离与发酵的耦合膜分离与发酵的耦合膜分离与发酵的耦合膜分离与发酵的耦合关于膜淤塞（fouling）问题循环膜反应器的问题在于膜的淤塞和随后通量的降低。对膜过滤系统和流体流动方式作适当改进可以缓解这一问题。在错流过滤作业中在膜上形成的微生物滤饼是过滤阻力的根源。因此，分析滤饼的结构对于阐明错流过滤的机制至关重要。关于膜淤塞（fouling）问题循环膜反应器的问题在于膜的淤关于膜淤塞问题通常，在操作过程中培养液沿切线方向被泵入膜过滤器循环，以免通量的减少。一些操作参数，如横跨膜的压力，料液循环速率对过滤通量均有影响。此外，流体特性，如细胞浓度和粘度，以及膜的特性，如孔径，表面电荷，可湿性和膜的阻力对过滤通量也有影响。关于膜淤塞问题通常，在操作过程中培养液沿切线方向被泵入膜过滤克服膜淤塞的措施BackflushCrossflowOperatingpressureFlowingrate……克服膜淤塞的措施Backflush膜技术在提高发酵产率方面的应用

膜技术在提高发酵产率方面的应用

膜技术在提高发酵产率方面的应用Kamoshita等(1998)设计了一种罐内安装有陶瓷膜的生物反应器，见图5-16,并用于乳酸的快速发酵。这一过滤装置可以在培养过程中进行抽滤，有可以用它来反冲清洗，补充蒸馏水。膜技术在提高发酵产率方面的应用Kamoshita等(1膜技术在提高发酵产率方面的应用

此过滤性能的改进提高了乳酸杆菌的生长速率与存活率，使培养液的上清液的稀释速率增加，乳酸杆菌细胞浓度达到178g/L,经178h培养，其存活率达98％。膜技术在提高发酵产率方面的应用此过滤性能的改进提高了乳膜技术在提高发酵产率方面的应用

用于乳酸快速发酵，细胞浓度达到80g/L时开始抽出上清液，并换新鲜培养基。用保留的细胞进行分批发酵，可重复6次。在每次发酵2个小时内可形成30g/L的乳酸。膜技术在提高发酵产率方面的应用用于乳酸快速发酵，细胞浓膜技术在提高发酵产率方面的应用(1)有机酸(2)乙醇，丙酮，丁醇发酵方面的应用(3)在工程菌培养方面的应用(4)超氧岐化酶生产方面的应用

膜技术在提高发酵产率方面的应用(1)有机酸膜技术在提高发酵产率方面的应用(5)在活性污泥处理废水方面的应用(6)在单克隆抗体生产(7)抗生素等次级代谢产物(8)维生素B12发酵膜技术在提高发酵产率方面的应用(5)在活性污泥处理废水方面细胞高密度培养

代谢产物的合成是靠菌(生产者)来完成的。菌量越多，自然产量也越大，条件是菌的生产力能保持在最佳状态和具备适当的生产条件，包括足够的产物合成所需的基质，前体，诱导物等和没有有害代谢物的积累。细胞高密度培养

代谢产物的合成是靠菌(生产者)来完成的细胞高密度培养

要满足这些条件不是件轻而易举的事情。细胞高密度培养曾成功地应用于各种代谢产物的生产，这也是它为什么一直受到重视的原因。细胞高密度培养

要满足这些条件不是件轻而易举的事情。细研究应用概况

细胞高密度培养一般是指微生物沉没培养时其细胞密度达到100g/L以上的水平。最早应用于生产单细胞蛋白，乙醇。采用多基质补料分批高密度发酵恒pH下保证硫链丝菌素获高产。Lee等采用高密度细胞培养生产羟基链烷酸的效果很好。研究应用概况细胞高密度培养一般是指微生物沉没培养时其细

达到细胞高密度的手段

可用于细胞高密度培养的生物反应器类型有常用的搅拌罐，和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器与振动陶瓷瓶等。达到细胞高密度的手段

可用于细胞高密度培养的生物反应达到高细胞密度的手段

以上介绍的一些反应器系统用于研究是很有效的。但在工业生产上，还是采用一般的搅拌罐与补料工艺来进行细胞高密度培养。因它简单，且生产潜力高，适合于进行多参数的相关控制。达到高细胞密度的手段

以上介绍的一些反应器系统用于研究存在问题

高密度细胞培养的主要问题是：在水溶液中的固体与气体物质的溶解度基质对生长的限制或抑制作用基质与产物的不稳定性和挥发性存在问题

高密度细胞培养的主要问题是：存在问题

产物或副产物的积累达到抑制生长的水平高的CO2与热的释放速率高的氧需求培养基的粘度不断增加存在问题

产物或副产物的积累达到抑制生长的水平达到细胞高密度的手段

为了达到高密度，需要大量的基质，在基础料耗竭后必需添加这些基质。常用氨(作为氮源)来控制pH。氨浓度必需保持低水平，因浓度高会抑制生长。达到细胞高密度的手段

为了达到高密度，需要大量的基质，达到细胞高密度的手段

近年来，大肠杆菌不仅是重组蛋白的产生菌，通过代谢工程也越来越多成为其它类型产物，如聚羟基丁酸、质粒DNA、芳香化合物等的产生菌。要达到细胞高密度，除了改造菌种，对过程的优化也还有很大的潜力。达到细胞高密度的手段

近年来，大肠杆菌不仅是重组蛋白的达到细胞高密度的手段

在好气培养中如碳源过量，不同的菌会形成的主要代谢副产物，大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸杆菌与酿酒酵母的副产物分别为乙酸、丙酸、乳酸和乙醇。通常限制碳源的供给可以阻止这些副产物的积累。达到细胞高密度的手段

在好气培养中如碳源过量，不同的菌达到高细胞密度的手段

现代监测技术，象固有的荧光光谱，荧光活化细胞的检测与流通细胞测定仪(flowcytometer)以及就地成象分析等的应用将会给细胞高密度培养提供更多的信息。达到高细胞密度的手段

现代监测技术，象固有的荧光光谱挥发性产物的回收与发酵耦合

膜蒸发(又称全蒸发pervaperation，简称PV)Kaseno曾将此法成功地应用于乙醇发酵。乙醇发酵受反应产物的抑制，其产率随产物浓度的增加而减少。挥发性产物的回收与发酵耦合

膜蒸发(又称全蒸发perv挥发性产物的回收与发酵耦合

在发酵过程中除去产物可以维持高的产率。采用一种用聚丙烯做的疏水多孔中空纤维膜组件作为乙醇选择性膜。挥发性产物的回收与发酵耦合在发酵过程中除去产物可以维持挥发性产物的回收与发酵耦合挥发性产物的回收与发酵耦合挥发性产物的回收与发酵耦合

微孔膜过滤器MF是在进行膜蒸发前用来除去悬浮杂质包括细胞碎片的。PV用于连续除去乙醇。罐底的过滤器是用来阻止固定化颗粒随发酵液流出。发酵罐的装量为3L。挥发性产物的回收与发酵耦合

微孔膜过滤器MF是在进行膜混合或共培养系统

混合或共培养系统可应用于某些发酵。Kondo等(1996)采用运动发酵单孢菌与醋酸杆菌混合培养由葡萄糖生产乙酸，前者负责把葡萄糖转化为乙醇，后者再将乙醇转化为乙酸。混合或共培养系统混合或共培养系统可应用于某些发酵。Kon

吸附发酵

此过程的原理是在发酵适当时机添加一种能选择性吸附产物而又对产生菌无害的吸附剂。发酵结束后，再从吸附剂洗脱回收产物。吸附发酵此过程的原理是在发酵适当时机添加一种能选择性吸吸附发酵

Stentelaire等(2000)在香兰酸转化为香兰素的培养中采用一种聚苯乙烯树脂，Amberlite树脂XAD-2（法国RohmetHass公司）来吸附香兰素(又称香草醛)。吸附发酵Stentelaire等(2000)在香兰酸转吸附发酵

在Pycnoporuscinnabarinus培养4天后将树脂颗粒直接加入到发酵罐中(100g/L)。加树脂后的第3天将树脂包括菌体一起过滤分离出来，用水洗涤，乙醇洗脱，可以从树脂回收总产量达80％以上的香兰素。吸附发酵在Pycnoporuscinnabarinu吸附发酵

在通气速率为30与90L/h的条件下添加树脂的批号，香兰素的生产明显提高，分别达到1398和1575mg/L，为对照(不加树脂)的1.4和1.3倍，其分子转化率为69.6和82.1％，其回收率为69.7和90％。吸附发酵在通气速率为30与90L/h的条件下添加树脂的混合或共培养系统

Tohyama等(2000)采用一种混合培养系统，由德氏乳杆菌把葡萄糖转化为乳酸，再由Ralstoniaeutropha将乳酸转化为聚-羟基丁酸(PHB)。混合或共培养系统

Tohyama等(2000)采用一混合或共培养系统

鉴于乳酸浓度对两种菌的生长都有影响，他们使用一种在线酶催化的乳酸和葡萄糖传感器及流动注射分析(FIA)系统，调节葡萄糖的添加速率来控制乳酸浓度在低于5g/L的水平。混合或共培养系统

鉴于乳酸浓度对两种菌的生长都有影响，发酵条件的影响及其控制

要想控制发酵，使其按人的意志转移，目前还不能完全办到。因影响发酵的因素实在太多。有些因素还是未知的，且其主要影响因素也会变化。发酵条件的影响及其控制

要想控制发酵，使其按人的意志转发酵条件的影响及其控制

因此了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握菌的生理代谢和过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。发酵条件的影响及其控制

因此了解发酵工艺条件对过程的影发酵条件的影响及其控制

微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件(包括培养基)。为此，了解生产菌种与环境条件，如培养基、罐温、pH、氧的供需等的相互作用，菌的生长生理，代谢规律和产物合成的代谢调控机制将会使发酵的控制从感性到理性认识的转化。发酵条件的影响及其控制

微生物发酵的生产水平取决于生产发酵条件的影响及其控制

化学工程和计算机的应用为发酵工艺控制打下另一方面的基础。研究发酵动力学，找出能适当描述和真正反映系统的发酵过程的数学模型，并通过现代化的试验手段和计算机的应用，也能为发酵的优化控制开创一个新的局面。发酵条件的影响及其控制

化学工程和计算机的应用为发酵工培养基对发酵的影响

许多用于生产贵重商品的培养基的配方一般都不发表，视为公司的机密。这说明发酵培养基对工业发酵生产的重要性。培养基对发酵的影响许多用于生产贵重商品的培养基培养基对发酵的影响

先进的培养基组成和细胞代谢物的分析技术加上统计优化策略和生化研究对于建立能充分支持高产、稳产和经济的发酵过程是关键的因素。培养基对发酵的影响先进的培养基组成和细胞代谢物的分析技发酵条件的影响及其控制

发酵条件的影响及其控制

发酵条件的影响及其控制

培养基的成分对微生物发酵产物的形成有很大的影响。每一种代谢产物有其最适的培养基配比和生产条件。发酵条件的影响及其控制

培养基的成分对微生物发酵产发酵条件的影响及其控制

通常，用于次级代谢物生产的复合培养基配方多半是经验性的，因对生产菌的性质及所需化合物的生物合成知道得不多。培养基配方的设计主要根据过去文献报道，并通过试验调整。表5-6若干复合原材料的成分（具体请查阅书P.252）发酵条件的影响及其控制

通常，用于次级代谢物生培养基的优化

工业发酵通常采用两种培养基，一种用于培养种子(存在多级培养)；另一种用于产物合成。前者的功能主要在于支持细胞的生长。种子培养基的优化的目标在于生长，也有着眼于产生最多的孢子。培养基的优化工业发酵通常采用两种培养基，一种用于培养种培养基的优化

生产培养基的功能不言而喻是为了高产，和合成所需的组分，以减少下游工序。通过对适当参数的仔细选择和优化可以筛选出高产和低成本的培养基。培养基的优化生产培养基的功能不言而喻是为了高产，和合培养基的优化

典型的培养基优化方法是每次试验只改变1个成分(一维搜索)。这种方法很快被强有力的统计学方法所取代。这些方法对新老菌种的培养基优化均很有效率。下面介绍几种优化培养基的统计数学方法：培养基的优化典型的培养基优化方法是每次培养基的优化(1)布列可特－博曼(Plackett-Burman)设计法(2)响应平面设计(Responsesurfacedesign)(3)均匀设计方法培养基的优化(1)布列可特－博曼(Plackett-Burm发酵过程优化

发酵过程优化的实质是代谢流优化的过程。发酵过程优化发酵过程优化的实质是代谢流基质浓度对发酵的影响及其控制

当葡萄糖浓度大于0.15g/L时便产生乙醇。为了阻止乙醇的形成需控制比生长速率和葡萄糖浓度分别低于0.22h－1和0.15g/L。在这种情况下采用补料-分批或连续培养可以避免Crabtree效应的出现。基质浓度对发酵的影响及其控制当葡萄糖浓度大于0.15基质浓度对发酵的影响及其控制基质浓度对发酵的影响及其控制温度对产物合成的影响

温度除了直接影响过程的各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，例如，氧的溶解度和基质的传质速率以及菌对养分的分解和吸收速率，间接影响产物的合成。温度对产物合成的影响

温度除了直接影响过程的各种反应速温度对产物合成的影响

温度还会影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能生产金霉素，在低于30℃下，合成金霉素的能力较强。合成四环素的比例随温度的升高而增大，在35℃下只产生四环素。温度对产物合成的影响

温度还会影响生物合成的方向。例如温度对产物合成的影响

近年来发现温度对代谢有调节作用。在低温20℃，氨基酸合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制作用比在正常生长温度37℃的更大。故可考虑在抗生素发酵后期降低发酵温度，让蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向产物合成。温度对产物合成的影响近年来发现温度对代谢有调节作用。发酵过程中pH变化的规律

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH通常是不一样的。这不仅与菌种特性，也与产物的化学性质有关。如各种抗生素生物合成的最适pH如下：链霉素和红霉素为中性偏碱，6.8-7.3；金霉素、四环素为5.9-6.3;青霉素为6.5-.6.8;柠檬酸为3.5-4.0。发酵过程中pH变化的规律微生物生长阶段和产物合成阶段的氧的供需对发酵的影响及其控制在28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有7mg/L左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中DO可在几分钟之内便耗竭，使DO成为限制因素。氧的供需对发酵的影响及其控制在28℃氧在发酵液中的100％氧的供需对发酵的影响及其控制临界氧是指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。氧的供需对发酵的影响及其控制临界氧是指不影响呼吸所允许的最低氧的供需对发酵的影响及其控制

值得注意的是，在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌，过高的DO对生长可能不利。

氧的有害作用是通过形成新生O，超氧化物基O2－和过氧化物基O22－，或羟基自由基OH－,破坏许多细胞组分体现的。氧的供需对发酵的影响及其控制值得注意的是，在培养过程中并氧的供需对发酵的影响及其控制有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感。好气微生物曾发展一些机制，如形成触酶，过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)，使其免遭氧的摧毁。次级代谢产物为目标函数时，控制生长不使过量是必要的。氧的供需对发酵的影响及其控制有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感。CO2对发酵的影响

溶解在发酵液中的CO2对氨基酸，抗生素等发酵有抑制或刺激作用。CO2对发酵的影响

溶解在发酵液中的CO2对氨基酸CO2对发酵的影响

CO2对细胞的作用机制是影响细胞膜的结构。溶解CO2主要作用于细胞膜的脂肪酸核心部位，而HCO3－则影响磷脂，亲水头部带电荷表面及细胞膜表面上的蛋白质。当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化。CO2对发酵的影响

CO2对细胞的作用机制是影响细胞膜CO2对发酵的影响

这将导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，生长受抑制，形态发生变化。CO2对发酵的影响

这将导致许多基质的跨膜运输受阻，影

混合效果

发酵的好坏很大程度上取决于混合的效果。有关混合与氧传质的理论请参阅Reuss的经典著作。混合效果

发酵的好坏很大程度上取决于混合的效果。有关混合效果

使用一7L发酵罐，两种不同形式的搅拌器，3种不同的补料分批培养模式进行研究。头两种模式是在装备有6平叶涡轮式搅拌器，在罐顶或罐底补料方式；第3种补料分批培养模式是采用斜6平叶涡轮式搅拌器，罐顶补料方式。混合效果使用一7L发酵罐，两种不同形式的搅拌器，3种不混合效果混合效果栅桨式(Maxblend)搅拌器

Hiruta等(1997)将栅桨式搅拌反应器(MBF)应用于透明质酸与-亚麻酸发酵[84]。所用的搅拌器是一种直径占罐内径10/13，做成一整体的栅桨式搅拌器,如图5-37所示。此搅拌器特别适用于高粘稠发酵液。栅桨式(Maxblend)搅拌器

Hiruta等(19栅桨式(Maxblend)搅拌器栅桨式(Maxblend)搅拌器栅桨式(Maxblend)搅拌器栅桨式(Maxblend)搅拌器

物理因素对发酵的影响

超声波微弱的超声波对细胞产生的破坏作用很小，能增强细胞膜的通透性，从而强化细胞的物质运输。它被广泛用于生物细胞的破碎、降解、变性与大分子共聚。它对胞内酶的生产起协同加速作用。在混合废纸的糖化与发酵期间超声波具有促进乙醇生产作用[85]。物理因素对发酵的影响

超声波物理因素对发酵的影响

超声波在庆大霉素发酵期间用超声波处理罐外循环的发酵液，结果明显促进抗生素的分泌(比未处理的提高3.8倍)，从而使总生物效价提高1.7倍[86]。超声波开始处理的时间与剂量对抗生素的发酵单位有影响。物理因素对发酵的影响

超声波物理因素对发酵的影响

微波微生物在微波处理下其自身分子会作高速运动，吸收微波能力，转化为热，出现的生物物理与生物化学变化，随后发生机体结构与机能的变化，称为生物效应。大剂量处理会导致菌的死亡。物理因素对发酵的影响

微波物理因素对发酵的影响

微波采用2450MHz，127.5W的微波，从庆大霉素发酵60h开始，每隔12h一次处理40s，直到120h发酵结束，结果使庆大霉素的分泌率提高近1倍，其生物效价提高近50％[87]。这是由于适当剂量的微波的次级效应，使菌体的膜渗透性变大，产物的反馈阻遏减轻，庆大霉素的生物合成加强所致。物理因素对发酵的影响

微波物理因素对发酵的影响磁场Tsuchiya等(1996)利用新构建的超导磁生物系统所产生的磁场研究不同磁场下对大肠杆菌生长的影响[88]。他们发现，高磁场(3.2-6.7特斯拉)对细菌的对数生长初期有不利的影响。但在静止期在高磁场下的细胞数目是对照的2－3倍，即在此期细胞数目下降的幅度在高磁场下减小。物理因素对发酵的影响磁场物理因素对发酵的影响磁场

非均匀磁场(5.2－6.1特斯拉)的影响比均匀磁场的要大得多。高磁场对细菌的影响在不同生长期的效果不一样。物理因素对发酵的影响磁场物理因素对发酵的影响电流电流对活细胞的作用的研究结果说明，对细胞的电刺激作用会诱发DNA与蛋白质的合成、膜渗透性与细胞生长的变化。Nakanishi等(1998)研究了电流对酵母生长与乙醇生产的影响[89]。物理因素对发酵的影响电流补料的判断和依据

在谷氨酸发酵中菌的某一生长阶段的摄氧率与基质消耗速率之间存在着线性关联。据此，补料速率可藉摄氧率控制，将其控制在与基质消耗速率相等的状态。补料的判断和依据在谷氨酸发酵中菌的某一生长阶段的摄氧率补料的判断和依据

测定分批加糖过程中尾气氧浓度，可求得摄氧率(OUR),OUR与糖耗速率(qSX)之间的关系式如式5-45所示。补料的判断和依据测定分批加糖过程中尾气氧浓度，可求得摄补料的判断和依据K

＝OUR/qSX

＝耗氧量(mmolO2)/糖耗(mmol)补料的判断和依据K＝OUR/qSX补料的判断和依据

利用K值和摄氧率可间接估算糖耗。按反应式5-46，理论上计算可得K值为1.5。但实际上最佳K值为1.75。C6H12O6

＋1.5O2

＋NH3C5H9O4N＋CO2＋3H2O（5-46）补料的判断和依据利用K值和摄氧率可间接估算糖耗。补料的判断和依据

图5-32显示3批谷氨酸发酵中糖浓度的控制受K值的影响。K＝1.51情况下糖耗估计过高，发酵罐中补糖过量；K＝2.16的情况下糖耗又过低；只有在K＝1.75的情况下加糖速率等于糖耗速率。补料的判断和依据图5-32显示3批谷氨酸发酵中糖浓度的补料的判断和依据补料的