免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则检测方法

免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则检测方法关键需要看你偶联的蛋白的特性。需要根据蛋白特性来选择不同的偶联方法，不同的偶联方法针对的功能基团不同，位置当然更加不固定了，活化剂种类更多，不是没有人回答你的问题，而是你的问题范围太广无法回答！我曾经做过小分子和蛋白质的偶联，有一些自己总结的综述，你可以参考以下：人工抗原合成常用的载体载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子；载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能；而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。常用来作为合**工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白25人)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质分子中的a和£-氨基(等电点8和10)、苯酚基、巯基(等电点为9)、咪唑基(等电点为7)、羧基(等电点2〜4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的B-和Y-羧基)等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性，可与半抗原中的对应基团结合。当然，这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境。牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度。此外，这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解时，其活性基团仍呈可溶状态，因此，这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质。近年来，有研究报道用人工合成的多聚肽（最常用的是多聚赖氨酸）作载体，表现出能增加半抗原的免疫原性，从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加，被广泛应用［31，32］。1.2.2人工抗原合成方法小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法，常用的方法如下：1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联1）混合酸酐法（mixedanhydridemethod）：也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，再与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺（EDC）使羟基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物（见图1.5）。EDC被称作零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1〜2h，置室温24h，再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。1.2.2.2含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键（-N=C，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4〜40℃及pH6.0〜8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物（见图1.6）。1.3.2.3含羟基半抗原的偶联1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯（带有羧基的中间体），再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基（图1.7）。2）羰基二咪唑法：N,N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试