第14章-沉淀与结晶课件

沉淀与结晶

PrecipitationandCrystallization

沉淀法与结晶法都是将溶质以固体形式从溶液中析出的方法，若析出的是晶体，则称为结晶；析出的是无定形物质，则称为沉淀。

沉淀和结晶本质上同属一个过程，都是新相析出的过程，两者的区别在于构成单位的排列方式不同，晶体的原子、离子或分子排列是规则的，而沉淀是不规则的。沉淀和结晶通常被统称为固相析出技术。7/28/20231沉淀法1.概述（1）定义：利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。（2）特点：操作简单、经济、浓缩倍数高（3）缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强；杂质含量高（4）种类：盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、非离子型聚合物沉淀、金属离子沉淀法等（5）一般操作过程加沉淀剂→陈化→分离（过滤或离心）2.1基本概念：盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度随盐浓度的升高会急剧下降，并产生沉淀，这种现象称为盐析。盐溶：在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高，溶解度略有上升，这种现象称为盐溶。2.2盐析原理（1）首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态－蛋白质溶于水的原因2.盐析法7/28/20233（2）原理a.盐离子中和pr分子表面电荷，静电斥力减弱。b.盐亲水性大于pr亲水性－破坏水化模PS：不同的pr结构不同，溶解度不同，盐所需要的浓度也不同－分级沉淀。a.两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。b.蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞。7/28/202342.3.1离子强度对盐析过程的影响(1）Cohnx经验公式S—蛋白质溶解度，mol/L;I—离子强度c:离子浓度；Z：离子化合价β，Ks—常数2.3盐析过程7/28/20235β－盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。（2）β和Ks的物理意义7/28/20236Ks盐析法(分级沉淀）：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；β盐析法(分级沉淀）：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。2.3.2盐析的方法7/28/202372.4.1选用盐析用盐的几点考虑 盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐溶解度受T影响小盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济2.4.盐析用盐的选择7/28/202382.4.2一般的规律为在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁7/28/202392.4.3常用的盐析用盐硫酸铵：溶解度大（767g/L），对T不敏感、分级效果好，对蛋白有稳定作用，价廉；具腐蚀性且缓冲能力差，硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐7/28/2023102.5影响盐析的因素(1)溶质种类的影响：Ks和β值(2)溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高(3)pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好(4)盐析温度-常温一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降7/28/2023112.6硫酸铵盐析操作（1）固体加入法：以少量多次方式缓慢加入硫酸铵，其用量由表可得。如：现有20ml料液，饱和度为20％，以加固体硫酸铵的方式盐析，需要达到的硫酸铵饱和度为40％，问需要加入多少固体硫酸铵？盐析饱和度（Saturation）的概念：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。（50％饱和度？）7/28/20231225℃硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度时，每升硫酸铵水溶液应加入固体硫酸铵的克数7/28/202313（2）加饱和硫酸铵溶液V-加入体积；V0－原液体积S3－所加硫酸铵的饱和度S2－需要达到的硫酸铵的饱和度S1－原液硫酸铵的饱和度PS：操作时注意事项a.Tb.分级盐析c.条件严格控制（有重复性）d.静止0.5－1h后过滤或离心（沉淀完全）e.搅拌7/28/2023143有机溶剂沉淀3.1概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。3.2原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降低了亲水性，导致脱水凝聚－破坏水化膜。7/28/202315（3）加有机溶剂后，pr等分子的空间结构可能发生变化，使内部疏水基团部分外露，并与有机溶剂的疏水基团结合成疏水层，从而使蛋白沉淀。3.3溶剂选择介电常数要小致变性作用要小毒性要小、挥发性适中水溶性要好（与水无限混溶）7/28/2023163.4有机溶剂沉淀的特点（1）分辨率高；（2）溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；（3）容易使蛋白质等生物大分子失活；（4）应注意在低温下操作；（5）成本高7/28/2023173.5常用的有机溶剂沉淀剂（1）乙醇：沉淀作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉淀；（2）丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；（3）甲醇介电常数小，60%乙醇的介电常数是48；丙酮的介电常数是22；容易获取7/28/2023183.6影响有机溶剂沉淀的主要因素（1）温度－预冷低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热）（2）搅拌速度－散热（3）溶液pH值：目标蛋白与杂质带有相同的电荷，pI附近；稳定性好（4）离子强度:离子强度低有利于沉淀，0.01－0.05mol/L（5）样品浓度:0.5－2%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低7/28/2023194.等电点沉淀4.1概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。4.2原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。7/28/2023207/28/202321操作时的注意事项：（1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低（2）溶质的稳定性（3）由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用7/28/2023225.其它沉淀法（1）非离子型聚合物沉淀法（PEG）（2）聚电解质沉淀法：聚丙烯酸（3）金属离子沉淀法（4）有机酸沉淀法：鞣酸、TCA等，可与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀（5）选择性变性沉淀a.选择性酸碱变性（TCA）b.热稳定性不同－热变性c.表面活性剂或有机溶剂选择性变性（SDS、氯仿）7/28/2023231.结晶的概念溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体。特征：晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列.固体有两种状态：结晶和无定形结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则结晶技术7/28/202324典型的晶体结构7/28/2023252.结晶操作的特点（1）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。（2）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。7/28/2023263.结晶过程分析饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；3.1基本概念7/28/2023273.2凯尔文（Kelvin）公式C2---小晶体的溶解度； C1---普通晶体的溶解度σ---晶体与溶液间的表面张力；ρ---晶体密度γ2---小晶体的半径；γ1---普通晶体半径R---气体常数； T---绝对温度溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有关。7/28/2023283.3结晶过程的实质结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程这一过程包括：溶质分子凝聚成固体分子有规律地排列在一定晶格中这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。7/28/2023293.4晶体的形成形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，因此，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。7/28/2023304.结晶步骤过饱和溶液的形成晶核的形成晶体生长其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。4.1一般步骤7/28/2023314.2温度与溶解度的关系由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与能量的传递过程，它与体系温度的关系十分密切。溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过饱和曲线表示7/28/2023324.3饱和曲线和过饱和曲线SS-饱和曲线TT-过饱和曲线T’T’-超溶解曲线7/28/202333（1）稳定区和亚稳定区a.在温度-溶解度关系图中，SS曲线下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；b.而在SS曲线和TT曲线之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；c.加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至SS线；d.介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区和养晶区7/28/202334（2）不稳定区在TT曲线的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至SS线（饱和）；晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，晶体质量差；因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓度控制在养晶区（亚稳定区），以利于大而整齐的晶体形成。7/28/202335（3）影响溶液过饱和度的因素a.饱和曲线是固定的b.不饱和曲线受搅拌、搅拌强度、晶种、晶种大小和多少、冷却速度的快慢等因素的影响（4）结晶与溶解度之间的关系晶体产量取决于溶液与固体之间的溶解—析出平衡；固体溶质加入未饱和溶液——溶解；固体溶质加入饱和溶液——平衡（Vs=Vd）固体溶质加入过饱和溶液——晶体析出7/28/2023364.4过饱和溶液的形成（1）冷却a.适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中。如：L－脯氨酸浓缩液至4℃，放置4h，大量晶体析出。b.自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）7/28/202337（2）部分溶剂蒸发法a.适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系；b.减压或常压蒸馏如：灰黄霉素的丙酮萃取液，真空浓缩除去部分丙酮后即可有晶体析出。7/28/202338（3）真空蒸发冷却法a.使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。b.设备简单、操作稳定7/28/202339（4）化学反应结晶a.利用化学反应产生一个更低可溶性的新物质，该新物质的浓度超过饱和溶解度，即有晶体析出；b.方法:加入反应剂或调pH如：红霉素醋酸丁酯提取液中加入硫氰酸盐，并调pH5.0，即生成红霉素硫氰酸盐析出。7/28/202340（5）解析法a.向溶液中加入某些物质，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而析出。b.物质－液体、气体、固体如：利用卡那霉素易溶于水不溶于乙醇特征，在卡那霉素加95％乙醇，卡那霉素硫酸盐析出。7/28/2023414.5晶核的形成晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面。(1)初级成核:过饱和溶液中的自发成核现象（不稳定区）。(2)二次成核：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生机理:

附着在晶体表面的微小晶体受到剪切作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。7/28/2023424.6晶核的成核速度定义：单位时间内在单位体积溶液中生成新核的数目。是决定结晶产品粒度分布的首要动力学因素；成核速度大：导致细小晶体生成因此，需要避免过量晶核的产生7/28/2023435.常用的工业起晶方法自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。7/28/202344晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶方法。7/28/2023456.影响晶体生长速度的因素(1)杂质：a.促进生长、抑制生长、影响晶体外形b.其透经不同：晶体内、吸附在晶体表面、晶体与溶液界面上的液层(2)搅拌：加速晶体生长、加速