血型检测技术 白细胞抗原系统检测技术

临床输血检验技术白细胞抗原系统检测技术学习目标1.什么是HLA？HLA等位基因的命名应遵循哪些原则？HLA-Ⅰ类、Ⅱ类及Ⅲ类基因的结构怎样？2.掌握PCR-SSP检测方法的基本原理、特点及其适应范围；掌握HLA分型在移植医学、输血医这和法医学中的应用3.

熟悉HLA血清学分型试验及淋细胞毒交叉配合试验的原理及质量控制HLA复合体HLA复合体的遗传特点单体型遗传

多态性遗传共显性遗传复等位基因连锁不平衡（linkagedisequilibrium）基因频率连锁不平衡现象的可能原因HLA复合体HLA-I类基因位于6号染色顶端经典HLA-I类基因：包括A、B、C三个基因座位，编码三组高免疫性、高度多态性的HLA-A、HLA-B、HLA-C糖蛋白分子。非经典HLA-I类基因：免疫功能关基因，包括E、F、G、H、J基因座位，编码免疫性和多态性均较低的分子HLA复合体HLA-II类基因位于6号染色着丝点经典HLA-II类基因（DP、DQ、DR）编码HLA-II类分子；非经典的HLA-II类基因（LMP、TAP、DM）为与抗原加工和递呈有关的基因。HLA复合体HLA-III类基因位于II类和I类基因中段经典HLA-III类基因编码产生C4、C2、B因子等HLA复合体HLA等位基因命名HLA-A*02：101：01：02N连字符基因座位分隔符基因组字段分隔符特异性HLA蛋白编码区DNA同义突变非编码区DNA差异指示表达发生变化HLA复合体按基因位点的产物分别命名抗原特异性用基因位点后的数字表示由细胞学技术及淋巴细胞试验确定的特异性的表示HLA抗原裂解后宽特异性的表示抗原特异性及基因位点之间的表示HLA分子组织分布HLA分子HLA分子分布HLA-Ⅰ类分子广泛分布在所有有核细胞表面HLA-Ⅱ类分子主要表达在如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等细胞表面HLA分子也分布在血、尿、唾液及精液中检出HLA分子淋细胞毒交叉配合试验HLA血清学分型试验+补体台盼蓝染液抗原与抗体结合当特异性抗体与待检淋巴细胞表面HLA分子结合后，激活补体，使细胞膜通透性增加或细胞死亡，加入染料后在显微镜下可见结合补体的细胞被活性染料着色。分离淋巴细胞HLA血清学分型试验待检淋巴细胞悬液静置30-40分钟兔补体静置60-70分钟5%伊红死细胞体积大，着黑色，无折光性；活细胞大小正常，未着色，折光性强，较透亮；微量淋巴细胞毒试验HLA血清学分型试验质量控制HLA抗原抗体最好选用单克隆抗血清抗体效价适宜存在剂量效应淋巴细胞要求活性和纯度高浓度为2～4×106/mL病理状态下HLA可能会表达异常孵育温度和时间严格掌握孵育时间最适温度为20-25℃其他补体染液应进行预试验；用甲醛固定设置阳性和阴性对照HLA血清学分型试验原理PCR—序列特异引物法编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。检测材料PCR—序列特异引物法——以B27检测为例

1、血样：0.2mlEDTA抗凝血

2、红细胞裂解液

3、白细胞裂解液

4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersetc操作流程一、DNA的提取1、取1ml红细胞裂解液入血样管中混匀，裂解红细胞;2、离心4000rpm2min;3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；4、取50ul白细胞裂解液入上述白细胞管中混匀；5、将白细胞管于60℃水浴消化20min；6、取出白细胞管再于100℃，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm2min。上清即为富含DNA的PCR模板。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例操作流程PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）

×12×2394oC2min

94oC12sec

65oC1min94oC12sec61oC50sec72oC30sec

37oC10sec

HLA-B27扩增程序PCR—序列特异引物法——以B27检测为例扩增产物电泳PCR—序列特异引物法——以B27检测为例扩增产物电泳制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例结果观察HLA-B27(+)标本电泳结果观察

PCR—序列特异引物法——以B27检测为例试剂操作：提取DNA最后一步，乙醇要挥发干净防止PCR污染质量控制PCR—序列特异引物法——以B27检测为例方法学评价方法评价PCR-SSP该方法操作简单、快速，耗时较短，结果判断简便，但可能出现漏孔或假性条带现象，为实验室最常用方法之一。PCR-SSOP操作较复杂，耗时较长，结果较准确，部分探针易出现干扰。目前被Luminex检测技术所替代。Luminex检测技术灵敏度高，操作简便，快速，结果较准确，是目前实验室中最常用的方法之一。PCR-SBT能够直接检测基因的核苷酸序列，属于高分辨方法，结果准确性最高，但需要特殊的仪器设备，耗时较长，成本较高。基因芯片技术具有超高速、高通量、低成本和高效益等优点，但分型可能存在一定的偏差。PCR—序列特异引物法——以B27检测为例白细胞抗原系统检测的临床应用在移植医学中的应用造血干细胞移植HLA相合同胞（ＭＲＤ）ＨＬＡ相合非血缘（MUD）单倍体脐体器官移植HLA－AHLA-BHLA-DR白细胞抗原系统检测的临床应用在输血医学中的应用HLA与非溶血性输血反应

(1)临床输血中发热性非溶血性输血反应多数是由于HLA抗体破坏白细胞后释放出热源物质引起；

(2)表现为头晕、面红、恶心、寒战，体温可高达39℃以上，严重者可并发肺部综合征，呼吸困难；

(3)采用白细胞滤器过滤后的血液输注，非溶血性输血反应明显减少。白细胞抗原系统检测的临床应用在输血医学中的应用HLA与血小板输注

(1)30％的HLA抗体阳性者对随机献血者的血小板输注无效；

(2)在血小板输注中HLA抗体的产生很少由血小板引起，多数由血小板血液中的白细胞引起；

(3)输血小板进行治疗时，最好测定HLA-A、B抗原，防止由于患者产生针对血小板膜HLA抗原的抗体。白细胞抗原系统检测的临床应用在法医学中的应用HLA与亲子鉴定

(1)由于HLA复合体的高度多态性，在无关个体间HLA表型全相同的机率极低，故HLA复合体被看作是