纳米探针和诊疗技术

纳米探针概念

纳米探针是一个能探测单个活细胞新型超微生物传感器.探头尺寸仅为纳米量级(1-100nm)。作为生物传感技术领域迅猛发展起来一项新型传感器,含有体积小、能在细胞内实时测量、对细胞无损伤或微损伤等很多特点，是研究单细胞最基本技术。在生物、医学、环境监测等各种领域得到广泛应用。纳米探针和诊疗技术第1页一、生物传感器1、概念：

生物传感器是以生物学组件为功效性识别元件,识别和感知目标被测量并将其按一定规律转换为可识别信号器件或装置。是用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理化学换能器有机结合一门交叉学科,也是物质分子水平快速、微量分析方法。(biosensor)纳米探针和诊疗技术第2页

2、组成：

1、感受器：分子识别元件，由含有分子识别能力生物活性物质组成;

2、换能器：电化学或光学转换元件。

二者组合在一起，用当代微电子和自动化仪表技术进行生物信号再加工，组成各种能够使用生物传感器分析装置、仪器和系统。

纳米探针和诊疗技术第3页3、特点：

（1）选择性好，专一性强；（只对特定底物起反应,而且不受颜色、浊度影响。）（2）灵敏度高，分析速度快；（能够在一分钟得到结果。）（3）样品需要量少，准确度高；（普通相对误差能够到达1％）（4）操作系统比较简单；（轻易实现微型化及自动分析）（5）成本低；（在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。）纳米探针和诊疗技术第4页4、分类：（1）按照其感受器中所采取生命物质可分为：DNA传感器免疫传感器酶传感器细胞传感器微生物传感器等等（2）按照生物敏感物质相互作用类型可分为：亲和型代谢型纳米探针和诊疗技术第5页

（3）按照传感器器件检测原理分类：Ｗｏｌｆｂｉｅｓ认为生物传感器是基于电化学或光学传感原理,标准上可分为：

电化学式：包含电位式、电流式、电导式；

光学式：包含吸光式、反光式、发光式。纳米探针和诊疗技术第6页二、纳米技术与生物传感器

纳米技术(nanometertechnology）是用单个原子、分子制造物质科学技术。其主要针对1～100ｎｍ之间尺寸,该尺寸处于原子、分子为代表微观世界和宏观物体交界过渡区域,这么系统既非经典微观系统亦非经典宏观系统,突出表现为表面效应、体积效应、量子效应和宏观量子隧道效应四大效应.

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纳米材料从根本上改变了材料结构,被公认为是21世纪最含有前途科研领域，是国际生物技术领域前沿和热点问题,在医药卫生,食品生产和监控,环境监测等领域有着广泛应用和明确产业化前景。近年来,纳米技术逐步进入生物传感器领域,引发突破性进展,在疾病诊疗、治疗和卫生保健方面发挥主要作用。纳米探针和诊疗技术第8页一）纳米颗粒与生物传感器1、纳米颗粒标识

磁性纳米颗粒可标识识别因子,其与肿瘤表面靶标识别器结合后,可在体外测定磁性颗粒在体内分布和位置,从而对肿瘤定位。

纳米金对许多生物人分子都有很强吸附作用,且吸附后不会使生物分子变性,当其与抗体结合后便可用来检测抗原；DNA经硫醇化后可固定于纳米金上，一个颗粒最多可结合几百个DNA分子,将其浸入溶液中便可捕捉待测液中靶DNA。纳米探针和诊疗技术第9页2、纳米颗粒用作固定载体纳米粒子含有高比表面积,用于生物分子固定,能够增加固定分子数量,从而增强反应信号。Singh等人用solgel方法合成硅纳米颗粒,其直径为20ｎｍ或200ｎｍ，该纳米颗粒用于固定乙酰胆碱脂酶,构建有机磷农药生物传感器，含有较高比表活性,结合离子敏场效应管检测,响应快速(<10ｓ),灵敏度高,对ParaOxon杀虫剂检测下限可达1×10-6mol/Ｌ纳米探针和诊疗技术第10页3、智能纳米颗粒

经过掺杂丁二炔单体进入两亲性磷脂纳米颗粒小体,在紫外照射下聚合,形成稳定微组装结构。在聚丁二炔头端修饰上含有特异识别功效生物分子,在溶液状态下,待测分子结合拉动聚丁二炔纳米颗粒结构改变,从而产生肉眼可见蓝-红颜色改变,结合紫外检测,结果更为灵敏,该方法有可能发展成一个简单、方便新型智能生物传感器。纳米探针和诊疗技术第11页二）多孔纳米结构与生物传感器

1、纳米微管用于生物分子固定如：聚吡咯纳米微管固定法：Miao等利用化学或电化学方法使吡咯单体在模板孔隙中生长,以得到与模板对应结构纳米管。这种微管含有统一直径,上下连通,管壁多孔特点。它含有较大比表面积,能容纳大量酶分子,并降低反应物和产物扩散障碍,有效地提升酶电极性能。纳米探针和诊疗技术第12页

2、纳米多孔硅薄膜对单晶硅进行电化学腐蚀能够得到含有纳米孔径多孔硅,这种材料含有室温可见发光和高比表面积(500ｍ2/ｃｍ3)特征,增加了可固定敏感分子数量,从而提升了灵敏度。在多孔硅表面固定抗体或者ＤＮＡ等敏感分子,经过检测光干涉和折射率改变,从而构建了一个新型免疫标识生物传感器,用于ｃＤＮＡ检测,灵敏度可达194.2ｆｍｏｌ/Ｌ。纳米探针和诊疗技术第13页三）纳米器件与生物传感器

1、纳米电线Rakitin等人研究发觉锌、镍、钴等离子能够并入ＤＮＡ双螺旋中心,在高ｐＨ值等基本条件下,能够稳定ＤＮＡ含有金属离子状态,取得了导电ＤＮＡ电线。而且,这类金属化ＤＮＡ依然保持选择性结合其它分子能力。利用该特点,能够开发遗传畸变探测生物传感器。纳米探针和诊疗技术第14页2、手持式纳米生物传感器

（悉尼海湾一粒方塘）澳大利亚ＡＭＢＲＩ有限企业悉尼试验室研制出一个手持式纳米生物传感器，经过模拟细胞膜,形成含有开关功效离子通道,当敏感膜与样本中受体结合,引发离子通道关闭,从而影响导电性能。这种纳米检测仪非常灵敏,可检测分子下限相当于悉尼海湾里溶解一粒方糖。其用途非常广泛,一个拇指甲大小传感器能在几分钟内,可从病人体液中确认病因。纳米探针和诊疗技术第15页3、纳米微悬梁生物传感器ＩＢＭ企业和瑞典Basel大学研究人员开发一个新型纳米微悬梁生物传感器,利用ＤＮＡ分子双螺旋机构,作为分子特异性识别能力模型。器件关键是硅悬梁天平阵列,长500μｍ,宽100μｍ,厚度为1μｍ。因为生物分子结合,从而引发悬梁臂弯曲,经过激光反射技术,该器件能够检测到10～20ｎｍ弯曲。在悬梁天平阵列表面固定含有不一样识别性分子,组成阵列式生物传感器,能够同时检测多项指标。纳米探针和诊疗技术第16页三、半导体量子点荧光探针

是基于半导体量子点(quantumdots,QD)发展起来生物亲和性多功效纳米荧光探针.含有独特光学性质，能在活体内或活细胞生理条件下对各种活细胞和活细胞内各种生物分子“编码”标识后，同时进行多组分、多色彩实时动态研究，在医学研究和诊疗技术开发中有辽阔应用前景。纳米探针和诊疗技术第17页一）基本组成结构及光学特征1、组成结构：

半导体量子点或称为半导体纳米微晶体(scmiconductornanocrystal)，它是由Ⅱ一Ⅵ族元素(如CdSe,CdS等)或Ⅲ一V族元素(如InP,InAs)组成尺寸小于1OOnm半导体纳米微晶体。当这些半导体纳米微晶体直径小于其玻尔直径(<lOnm)时，这些半导体纳米微晶体因为受到量子尺寸效应和介电限域效应影响，表现出其独特光学特征。纳米探针和诊疗技术第18页2、光学特征

①激发光波长范围宽且连续分布，而发射波长范围窄且呈对称分布，斯托克斯位移大，不一样半导体材料量子点或同一材料不一样粒径大小量子点在同一光源照射下发射出不一样颜色光.纳米探针和诊疗技术第19页②含有严格量子尺寸效应，经过改变量子点粒径大小可取得从紫外到近红外范围(即从蓝色到红色波长范围)内任意点光谱。量子点这些光特征十分适合于医学研究中经常需要在活细胞体系或活体内同时实时监测各种细胞间相互作用或细胞在受到某种内外刺激时其细胞内各种生物分子改变情况。纳米探针和诊疗技术第20页③半导体量子点荧光量子产率高，发光度强，光化学稳定性好，不易被光解或漂白。核一壳结构半导体量子点发光强度比当前用有机荧光染料分子强20倍，光化学稳定性则提升了100倍以上，这有利于对标识物进行长时间观察研究。

纳米探针和诊疗技术第21页二）生理条件下在恶性肿瘤中研究

当前经过在量子点表面包覆一层亲水性物质或在其表面修饰上亲水性官能基团，使半导体量子点含有水溶性和生物相容性，同时利用量子点表面亲水性包覆层或修饰亲水性官能团，经过静电引力、化学键结合、抗原抗体结合、受体配体结合和生物素结合等方法实现量子点荧光探针与靶细胞或细胞内研究对象生物分子特异性地结合。纳米探针和诊疗技术第22页1、对肿瘤细胞同时进行多通道、长时间观察

Wu等用链酶亲合素(streptavidin)与不一样粒径量子点连接，制备了量子点一链酶亲合荧光探针(QDs-streptavidin)，分别连接抗体和生物素，经过抗原一抗体结正当和生物素法分别同时特异性地标识乳腺癌细胞膜上Her2受体蛋白、细胞质中微管蛋白和细胞核中核抗原蛋白，在同一光源照射下，观察到不一样颜色、极易区分荧光，到达了对活细胞内各种蛋白分子直接“阅读”。纳米探针和诊疗技术第23页

Jaswal等用两种方法分别对HeLa细胞用量子点标识，首先用二氢叶酸包裹量子点，然后经过内吞作用将量子点标识在HeLa细胞囊泡内，标识量子点第12天仍稳定存在于细胞中;另外经过量子点与生物素连接而成量子点一生物素(QDs-avidin)荧光探针，对表面生物素化HeLa细胞膜进行特异性标识，结果表明:标识半导体量子点在活细胞内能连续承受激发光(5Omw,488nmlaser)照射14小时而荧光强度不发生显著减退，在12天后细胞内仍能检测到可见荧光。纳米探针和诊疗技术第24页2、对生物分子运动、分布及信号传导研究

Lidke等用量子点联合荧光蛋白技术对人表皮癌细胞A431HER家族erbB介导信号传导进行可视化研究.他们先将人表皮癌细胞A431erbBl,erbB2分别与绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白融合，得到稳定表示后，将量子点与表皮生长因子(EGF)连接而成量子点一表皮生长因子荧光探针(QDs-EGF)，直接可视化观察了QDs-EGI与erbB受体相互作用以及这些信号分子受刺激后它们运动情况。纳米探针和诊疗技术第25页3、非侵入性活体成像

Kim等用量子点荧光探针研究乳腺癌前哨淋巴结.用磷酸氢包裹发射波长为840一860nm量子点，然后将量子点分别经过小鼠模型足垫皮内和猪模型股部皮内注射，经过活体成像在体外可分别清楚显示距皮肤1cm下腹股沟和腋下前哨淋巴结以及周围淋巴管道，并经手术切除后组织学证实该方法特异性，到达了体外对前哨淋巴结“光学活检”目标。纳米探针和诊疗技术第26页三）CdTe量子点荧光探针研制

自年开始本中心纳米试验室开展水相合成CdTe量子点及其应用相关研究,年两位生物医学工程硕士学位硕士在毕业论文答辩中汇报了CdTe量子点在生物标识、基因转染和肿瘤光动力学治疗方面研究结果，得到答辩委员会各为教授高度评价。纳米探针和诊疗技术第27页水相合成CdTe量子点荧光探针介绍主要材料纳米探针和诊疗技术第28页水相合成CdTe量子点荧光探针介绍主要材料纳米探针和诊疗技术第29页试验方法水相合成CdTe量子点荧光探针介绍纳米探针和诊疗技术第30页水相合成CdTe量子点荧光探针介绍试验方法纳米探针和诊疗技术第31页水相合成CdTe量子点荧光探针介绍试验方法纳米探针和诊疗技术第32页（四）量子点偶联蛋白水相合成CdTe量子点荧光探针介绍试验方法纳米探针和诊疗技术第33页试验结果水相合成CdTe量子点荧光探针介绍纳米探针和诊疗技术第34页试验结果水相合成CdTe量子点荧光探针介绍纳米探针和诊疗技术第35页四、纳米磷光探针制备及特征纳米磷光探针是将磷光染料包埋或键合在生物兼容性好惰性基质中，利用微注射、基因枪轰击、脂质体转移等方法将其转入细胞中，从而对细胞内特定物质进行检测。

同荧光相比，磷光含有较大Stokes位移、与激发光谱重合少，寿命长等特点，所以其含有更加好选择性。纳米探针和诊疗技术第36页一）纳米磷光探针制备试剂：1一溴一2一甲基萘(ACROS，ORGANICS)；甲基丙烯酸(ACROS，ORGANICS)；硫酸铜(北京化学试剂三厂，分析纯)；烯丙基溴(ACROS，ORGANICS)；十二烷基硫酸钠(天津市博迪化工有限企业，分析纯)；氯化汞(北京化工厂，分析纯)；氯化钡，氯化钙，氯化钴，硫酸锌，氯化镍等纳米探针和诊疗技术第37页纳米磷光探针制备仪器：荧光光谱仪(CaryEclipse，Vafian)，Jy92一Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限企业)；TEM电子透射扫描仪(HITACHIH一600)；透析袋(上海生工，SP133116)；TU一1901紫外一可见吸收光谱仪(北京普析通用企业)。纳米探针和诊疗技术第38页纳米磷光探针制备制备方法：1、2g镁粉和7mL烯丙基溴反应制得Grignard试剂。2、用1-溴-2-甲基萘同N-溴代丁二酰亚胺反应得到1-溴-2-溴甲基萘(BBN)。3、取l-溴-2-溴甲基萘10．45g，与Grignard试剂反应，得到1-溴-2-(3-丁烯基)萘

4、硅胶柱深入纯化，再用乙醇配成0．107mol／L溶液。取甲基丙烯酸与适量十二烷基硫酸钠，二次水定容至40mL。在超声下搅拌。

纳米探针和诊疗技术第39页纳米磷光探针制备结果：

磷光纳米探针颗粒平均尺寸为(40±10)nm，分布在30-50nm之间数量占到85％。

纳米探针和诊疗技术第40页二）纳米磷光探针特征分析纳米磷光探针磷光光谱：

在波长为288nm光激发下磷光发射带峰值为532nm，在不通氮除氧条件下磷光强度为149。在通入N条件下能够得到强度为633磷光.

纳米探针和诊疗技术第41页纳米磷光探针特征分析溶剂极性对探针磷光影响三种溶剂对纳米探针磷光强度影响所对应猝灭方程分别为：Ya=-0.487+6O.2；yb=-0.709x+6O.5；yc=-0.767+58.8(探针在极性强溶液中稳定性更加好)纳米探针和诊疗技术第42页纳米磷光探针特征分析磷光探针对铜离子传感

浓度在1.0×10～1.0×10-4mol／L范围内，纳米探针磷光强度逐步衰减.Stern-Volmer猝灭常数Ksv=2.48×lOs纳米探针和诊疗技术第43页纳米磷光探针特征各种金属离子对纳米探针磷光强度影响

金属离子在1.0×10～1.0×10-3mol／L范围内，纳米探针磷光强度变化很小，但随Hg2浓度增加，纳米探针磷光增强

纳米探针和诊疗技术第44页三）、结论:

在优选条件下合成生物兼容性聚甲基丙烯酸基纳米磷光探针含有很好水溶性，在非除氧条件下，产生较强磷光发射信号。1.0x10mol／L铜离子对磷光信号含有很好选择性猝灭作用，可用于生物条件下铜离子传感。纳米探针和诊疗技术第45页五、光纤纳米探针

光纤传感器是当分子识别元件与底物(待测物)特异结合后,产生能够输出特征光学信号(荧光、颜色改变等),从而分析检测待测物传感器。利用纳米光纤探针和纳米级识别元件可检测微环境中生物、化学物质，能够监测微环境(如:细胞、亚细胞结构)中各成份浓度渐变以及其在空间不均一性。其主要包含光纤荧光生物传感器、光纤免疫传感器、分子信标传感器、无转换器细胞内生物传感器等。纳米探针和诊疗技术第46页一）光纤纳米荧光传感器

工作原理：

在光纤头部固定荧光剂,荧光剂与质子发生可逆反应时,引发试剂相光学性质改变,光变信号由光纤传输,测定荧光强度改变,以检测定底物浓度或PH值。纳米探针和诊疗技术第47页制作方法：1）将光纤用光纤拉制仪制成头部直径为100～1000ｎｍ光纤探针；2）用真空蒸发器在光纤表面镀上铝；3）将暴露光纤头部硅烷化。4）在光纤头部结合上一个ｐＨ选择性荧光染料聚合物；5）传感器性能检测(包含检测范围、响应时间、使用寿命、稳定性等)。纳米探针和诊疗技术第48页特性：

该纳米传感器响应时间为300ｍｓ,比传统光纤传感器响应时间缩短1%以上,ｐＨ浓度检测下限低于传统传感器六个数量级。这些特征使之适宜于对单个细胞和亚细胞结构检测。

纳米探针和诊疗技术第49页

Ｂａｒｋｅｒ等人构建了一个胶体金ＮＯ纳米传感器。制作该传感器包含拉制光纤、硅烷化、胶体金附着、蛋白结合、荧光标识等。该传感器头部直径为200ｎｍ,包被了特异性结合ＮＯ亚铁细胞色素Ｃ’和对应荧光染料。试验者以此传感器检测小鼠巨噬细胞内ＮＯ水平,检出限为20μｍｏｌ～1ｍｍｏｌ,响应时间为0.5ｓ。纳米探针和诊疗技术第50页二）光纤纳米免疫传感器

光学免疫传感器是将光学与光子学技术应用于免疫法,利用抗原抗体特异性结合性质,将感受到抗原量或抗体量转换成可用光学输出信号一类传感器.这类传感器将传统免疫测试法与光学、生物传感技术优点集为一身,使其判定物质含有很高特异性、敏感性和稳定性。

光纤纳米免疫传感器是在其基础上将敏感部制成纳米级,既保留了光学免疫传感器很多优点,又使之能适合用于单个细胞测量。

纳米探针和诊疗技术第51页Ｄｉｎｈ等人成功地研制出一个用于检测ＢＰＴ光纤纳米免疫传感器,传感器头部生物探针上结合了特异性单克隆抗体,经过抗原抗体特异性结合,能够检测单个细胞内生物化学物质。纳米探针和诊疗技术第52页制作方法：

首先,用光纤拉制仪将石英光纤拉得极为细小(10～100ｎｍ)探针,;

然后将光纤头部硅烷化,为抗体产生黏附位点，将特异性识别并结合ＢＰＴ抗体结合到光纤头部;

随即将光纤全长(结合了特异性抗体光纤头部除外)镀银以预防光漏出。纳米探针和诊疗技术第53页

在专用于单细胞操作显微操纵仪/显微注射器上进行细胞穿刺及检测试验，用细胞培养箱使操纵台温度保持在试验细胞所需37℃,使用光电倍增管统计ＢＰＴ与抗体结合后产生荧光。该传感器最低检出限是10-21ｍｏｌ。

检测方法：纳米探针和诊疗技术第54页纳米探针和诊疗技术第55页

特点：

1）能进行定量检测；

2）能实时监测抗原抗体反应,无需进行分离步骤,便于抗原抗体反应动力学分析；

3）含有更高特异性；因为抗原抗体反应是高度特异性,从而降低了环境中非特异性干扰；

4）能用于检测传统光学免疫传感器无法检测细胞内物质。纳米探针和诊疗技术第56页三）分子信标生物传感器

原理：将一短核苷酸序列端点标识可发荧光试剂,当此结构与配正确短核苷酸序列结合时,则能量转移而产生特征光学信号,经过光检测探头传递至光检测器组成传感器。

纳米探针和诊疗技术第57页

这类传感器中较为经典是ＤＮＡ光纤生物传感器。它是将杂交分子中探针标识物经生化反应产生特征光学信号,经过光纤经光检测器检测,从而测定出杂交分子(含目标基因量）。其优点是检测杂交反应后产生特征光信号,选择性强,易于排除杂交过程中非特异性吸附干扰,测定准确;因不采取放射性同位素标识,安全性好。纳米探针和诊疗技术第58页

Liu等将生物素化DNA分子信标固定在光纤表面，制成了渐消逝波激发DNA分子信标生物传感器。采取光纤针尖端固定分子信标直接激发，利用增强型电感耦合器(ICCD)取得光纤针尖图像，能够监测杂交动力学过程。用这种灵敏传感器制备传感器阵列，能够对溶液中各种DNA进行同时分析检测纳米探针和诊疗技术第59页

Perlette等也利用微注射法引