结核病实验室诊断技术及其进展-课件

结核病实验室诊断技术及其进展中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心国家结核病参比实验室赵雁林2006年5月

结核病的诊断

实验室诊断需要关注的问题

WHO推荐的肺结核的诊断标准肺结核的实验室诊断结核病的实验室诊断新技术内容1.结构基因组学向功能基因组学转变2.基因组学向蛋白组学转变3.以作图为基础的基因鉴定向以序列为基础的基因鉴定转变4.单基因病研究向多基因病研究转变生物医学研究模式发生变化趋势生物医学研究模式发生变化趋势（续）5.对疾病的特异性DNA诊断向疾病易感性鉴定转变6.分析单个基因作用向研究基因作用的调控机制转变7.研究疾病的病因向研究疾病的病理发生机制转变8.研究单一种属向研究多种种属转变。M.tuberculosisH37Rv

ColeSTetal.Nature1998;393:537.441.1万碱基对3924预测基因（3995predictedprotein-codinggenes)65.6%GC含量重复DNARepetitiveDNAintheMycobacteriumtuberculosisComplex分类：1.串联重复序列TandemRepeats(TRs）

卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNAVNTR2.散在重复序列InterpersedRepeatsGC富含重复序列和主要的串联重复序列PolymorphicGC-RichRepetitiveSequence&MajorPolymorphicTandemRepeatsPGRS&MPTSPE\PPEMycobacterialInterspersedRepetitiveUnits

MIRUs根据长度、序列组成分为三个subfamilies,在H37Rv中大小在46到101bp,有65个拷贝的MIRU在41个loci中出现。MIRU与其它已知重复序列的不同点：结构特点（无明显的回文结构）插入位点编码能力具有散在重复序列和VNTR序列的双重特点散在重复序列范围：基因复制短的序列重复移动的遗传元件ISElementsREP13E12FamilyProphageCRISPRSequences(spoligotyping)

clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats实验室检查实验室检查的目的是为了疾病的诊断，要求检测出标本中某物质的真实含量和反应。真实物理含量，即所谓“真值”由于人类认识能力的局限性，使得误差不能完全避免。误差分类：过失误差方法误差（系统误差、随机误差）抽样误差生物误差肺结核的诊断

结核病人因症就诊是病人发现的主要方式涂片显微镜检查对于传染性、预后和治疗评价有一定作用。

X-线对于结核病的诊断不是一种特异性的方法

核酸扩增试验和血清学方法对于结核病的诊断有一定的价值（有待进一步研究）

Ⅰ缓慢生长光产色堪萨斯、海、猿分枝杆菌

Ⅱ缓慢生长暗产色瘰疬、苏加

Ⅲ缓慢生长不产色鸟胞内蟾分枝杆菌

Ⅳ

快速生长偶发、龟非结核分枝杆菌不能使豚鼠致病1886年Lenman和Neaman命名结核分枝杆菌非结核分枝杆菌生物标本生物样本成分千差万别合格的标本如果每毫升灌洗液中超过105个集落形成单位，某一微生物存在，且有该微生物感染的其他临床表现，则该微生物可能就是病原菌流感病毒和呼吸道合胞体病毒正常情况下不存在于呼吸道。

经典免疫学认为，结核的免疫属于传染免疫（infectionimmunity),又称有菌免疫，即只有当结核菌在体内存在时才有免疫力，一旦体内的细菌被杀灭，免疫力随即消失。机体对结核分枝杆菌能产生抗体，但无免疫保护作用。

TBacceleratestheprogressionofHIVdisease结核免疫结核病的诊断咳嗽、咯痰大于等于3周AFBX3

广谱抗生素治疗10-14天如果症状没有改善,重复

AFB,X-线诊断

TB

抗结核治疗If1positive,X-rayandevaluationIf2/3positive:Anti-TBRx阴性显微镜涂片检查较

X-线检查更客观、可信专家组一直同意诊断特异性显微镜涂片检查的特异性较X-线检查好X-线诊断结核病的过诊问题NTI,IndJTuberc,1974过诊HIV/AIDS中涂阳肺结核病人的比例010203040506070HIVNegativeEarlyHIVLateHIVAFBpositivityinTBpatients积极治疗传染源可以减少结核病的传播涂阳病人的传染性是涂阴病人的4-20倍如果不给予治疗一个涂阳病人可以传染10-15人/年如果不给予治疗涂阳病人更容易死亡RouillonA.Tubercle1976;57:275-99结核病变在体内的演变和播散

传染途径结核病的传染系由细小飞沫而发生饮用来自病牛的牛奶而罹患肠结核

在没有HIV感染的人群中，结核杆菌感染者在其一生中大约有10%的人会发病

IntheabsenceofHIV,about10%ofpeopleinfectedwithTBwilldevelopTBdisease.

在TB/HIV双重感染者中约50%的感染者会成为结核病患者

Inpeopleco-infectedwithHIVandTB,about50%maydevelopTBdisease

TB加速和恶化HIV/AIDS的疾病进展TBacceleratestheprogressionofHIVdiseaseTB和HIV双重感染TBandHIVco-infection

TB是PLWHA人群中的主要致死原因

TBistheleadingcauseofdeathinpeoplelivingwithHIV&AIDS

不管是否感染HIV，结核病是可以被治愈的传染病

TBcanbecuredwhetherapatientisco-infectedwithHIVornot,withthesametreatmentregimenTB和HIV双重感染TBandHIVco-infection(cont’)低治愈率

Lowcurerate高死亡率Highmortalityratesduringtreatment高复发率HighratesofTBrecurrence问题Problems涂阴肺结核的过诊Over-diagnosisofsputumsmear-negativePTB涂阳肺结核的漏诊Under-diagnosisofsputumsmear-positivePTB肺外结核病的误诊Misseddiagnosisofextra-pulmonaryTB问题Problems（cont’)Internationalstandardsfor

Tuberculosiscare

结核病关怀----国际标准

Diagnosis:标准1.所有不能解释的进行性、持续咳嗽2-3周的可以症状者都应该进行结核病相关检查STANDARD1.Allpersonswithotherwiseunexplainedproductivecoughlastingtwo–threeweeksormoreshouldbeevaluatedfortuberculosis.诊断Diagnosis标准2.所有肺结核的可疑症状者都应该进行痰涂片显微镜检查（至少两次痰涂片检查，至少包含一份晨痰）STANDARD2.Allpatients(adults,adolescents,andchildrenwhoarecapableofproducingsputum)suspectedofhavingpulmonarytuberculosisshouldhaveatleasttwo,andpreferablythree,sputumspecimensobtainedformicroscopicexamination.Whenpossible,atleastoneearlymorningspecimenshouldbeobtained.诊断Diagnosis标准3.所有的肺结核可疑症状者，都应该对其病变部位来源的合格标本进行显微镜涂片检查，如果条件允许可以做培养和组织病理学检查。STANDARD3.Forallpatients

(adults,adolescents,andchildren)suspectedofhavingextrapulmonarytuberculosis,appropriatespecimensfromthesuspectedsitesofinvolvementshouldbeobtainedformicroscopyand,wherefacilitiesandresourcesareavailable,forcultureandhistopathologicalexamination.诊断Diagnosis标准4.所有胸部影象学检查可疑肺结核的病人，应该对其痰标本进行微生物学检查。Standard4.Allpersonswithchestradiographicfindingssuggestiveoftuberculosisshouldhavesputumspecimenssubmittedformicrobiologicalexamination.诊断Diagnosis标准5.涂阴肺结核的诊断标准：至少3个痰涂片检查阴性；胸部影象学检查可疑肺结核；对广谱抗生素试验性治疗无效（除外喹诺酮类）。对这样的病人如果条件允许，应该做培养；对已知或疑似HIV感染者，应加快对其的诊断进程。STANDARD5.Thediagnosisofsputumsmear-negativepulmonarytuberculosisshouldbebasedonthefollowingcriteria:atleastthreenegativesputumsmears(includingatleastoneearlymorningspecimen);chestradiographyfindingsconsistentwithtuberculosis;andlackofresponsetoatrialofbroad-spectrumantimicrobialagents.(NOTE:BecausethefluoroquinolonesareactiveagainstM.tuberculosiscomplexand,thus,maycausetransientimprovementinpersonswithtuberculosis,theyshouldbeavoided.)Forsuchpatients,iffacilitiesforcultureareavailable,sputumculturesshouldbeobtained.InpersonswithknownorsuspectedHIVinfection,thediagnosticevaluationshouldbeexpedited.诊断Diagnosis标准6.对有症状的涂阴儿童胸腔结核患者的诊断应该根据胸部影象学检查可疑肺结核、暴露史或结核感染（TST阳性或γ干扰素释放试验）。对这样的病人如果条件允许，应该通过（排出物、洗胃或引痰等方式）得到痰标本进行培养。STANDARD6.Thediagnosisofintrathoracic(i.e.,pulmonary,pleural,andmediastinalorhilarlymphnode)tuberculosisinsymptomaticchildrenwithnegativesputumsmearsshouldbebasedonthefindingofchestradiographicabnormalitiesconsistentwithtuberculosisandeitherahistoryofexposuretoaninfectiouscaseorevidenceoftuberculosisinfection(positivetuberculinskintestorinterferongammareleaseassay).Forsuchpatients,iffacilitiesforcultureareavailable,sputumspecimensshouldbeobtained(byexpectoration,gastricwashings,orinducedsputum)forculture.诊断Diagnosis当前可得的结核病诊断方法WhatmethodsareavailablenowtodetectTB涂片显微镜检查(Microscopy)ZNFM培养(Culture)ConventionalmediaMGITBACT-3DALERTESPetc.核酸扩增法（NAAT）

AmplicorMTB、MTDGen-Probe、SDAQuanti-PCRGenechip血清学方法(Serologicalmethod)

QuantiFERONT-SPOTTBELISA

etc.其他(Other)

FAST-Plaque(phage)HPLCetc.传统的结核病实验室检查方法

#

Capacitytodetectwhen≥10,000bacillipermlsputum*Capacitytodetectwhen≥102-3CFUpermlsputum

ZNFMSolidLiquidPPDSensitivity40-60%50-70%85%70-85%?Timing48hours48hoursupto8weeks2weeks72hoursCost

cheapexpensivecheapexpensivecheapStain#

Culture*TST真空采血管使用指南1.8,2.4,4.0,5.0抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:4采血后立即颠倒混匀8次→试验前混匀标本全血血细胞沉降率试验

Black

黑色1.8,2.0,2.7,4.5抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:9采血后立即颠倒混匀8次→试验前混匀标本全血血液凝固试验

LtBule

浅兰色2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,10.0抗凝剂:K2EDTA或K3EDTA采血后立即颠倒混匀8次→试验前混匀标本全血血液学常规试验

Lavender

紫色5.0抗凝剂K2EDTA和惰性分离胶采血后立即颠倒混匀8次室温离心1100g，10分钟血浆分子生物学诊断

White

白色2.5,3.5,4.0,5.0,6.0,9.5,11.0,13.0惰性胶体促凝剂采血后立即颠倒混匀5次→静置30分钟→离心血清快速血清分离生化

Gold

金黄色管2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,10.0抗凝剂:肝素钠、锂、氨采血后立即颠倒混匀8次→离心血浆快速血浆生化

Green

绿色3.0,5.3,7.0促凝剂：纤维蛋白酶采血后立即颠倒混匀8次→静置5分钟→离心血清快速血清生化

Orange

桔红色2.0,3.0,4.0,5.0,7.0,10.0,15.0,20.0无（内壁涂有硅酮）采血后不需颠倒混匀→

静置1小时→离心血清血清生化

Red

红色采血量(ml)添加剂制备步骤标本类型临床用途管盖颜色痰涂片显微镜检查Z-N萋尼二氏染色,需要5,000-10,000个CFU/毫升100x油镜看完300个视野大概需要15分钟40-70%灵敏度,90%特异性

FM荧光染色灵敏度较ZN染色高10%UnevenToothickSloughedoffUnderdecolorizedGoodSmearPoorSmear萋尼氏染色不同痰标本呈现的物理性状唾液脓痰血痰粘液痰（水样）

CultureoftheorganismsLiquefaction,decontamination,concentrationSoildmedia-Egg-based(Lowenstein-Jensen),agar-based(Middlebrook7H10and7H11),biphasicmediaLiquidmedia-Middlebrook7H9,7H12IdentificationbybiochemicaltestsTheentireprocess:4to6weeksDrugsusceptibilitytest:add3to6weeks

BACTECTBsystemTubeswithafluorescentcompoundinsiliconebottom,whichissensitivetooxygenpresenceComparisonoftheBACTECMGIT960withLowenstein-Jensenmedium(1-2wvs6-8w)Therecoveryrates-94%(117/124)vs75.8%(94/124);TTDs(timetodetection)-10.7vs30.6dDisadvantage-inabilitytoobservecolonialmorpgology,mixtureculture,highcostChienHPetal,IntJTubercLungDis,2000

SerodiagnosisofTuberculosisAntigen60IgG(%)IgM(%)ActivePTB(n=147)76.29.52ActiveEPTB(n=90)58.910InactiveTB(n=153)18.31.6NonTBdz(n=517)9.70.6Sensitivity69.610.5Specificity92.199.4Positivepredictedv67.9Negativepredictedv89.2LuhKT,YuCJ,Respirology1996MethodSensitivitySpecificityPredictivevalue(%)Accuracy(%) (%)PositiveNegative(%)COBASAMPLICOR 80.6100100 98.6 98.6Culture 86.1 10010099.099.0Microscopy 36.199.495.465.0 94.2Polymerasechainreaction(PCR)JanISetal,JFormosMedAssoc1998FactorsContributingtotheIncreaseinTBCasesHIVepidemicIncreasedimmigrationfromhigh-prevalencecountriesTransmissionofTBincongregatesettings(e.g.,correctionalfacilities,long-termcare)DeteriorationofthepublichealthcareinfrastructureTransmissionand

PathogenesisofTBCausedbyMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis)SpreadpersontopersonthroughairborneparticlesthatcontainM.tuberculosis,calleddropletnucleiTransmissionoccurswhenaninfectiouspersoncoughs,sneezes,laughs,orsingsProlongedcontactneededfortransmission10%ofinfectedpersonswilldevelopTBdiseaseatsomepointintheirlivesSitesofTBDiseasePulmonaryTBoccursinthelungs85%ofallTBcasesarepulmonary

ExtrapulmonaryTBoccursinplacesotherthanthelungs,includingthe:Larynx LymphnodesPleura(membranesurroundingeachlung)BrainandspineKidneysBonesandjointsMiliaryTBoccurswhentuberclebacillienterthebloodstreamandarecarriedtoallpartsofthebody不是每个暴露在传染源中的人都会被传染

Probabilit