蛋白质的共价结构课件

第二节

蛋白质的共价结构蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。

蛋白质的化学组成蛋白质分子中主要的元素组成是：C、H、O、N、S等。其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数

6.25

（凯氏定氮法）蛋白质的分类1.蛋白质形状球状蛋白纤维状蛋白蛋白质的分类根据分子形状分类球状蛋白质纤维状蛋白质缀合蛋白质根据组成分类简单蛋白质溶解度分类营养价值分类膜蛋白2.分子组成简单蛋白（按溶解度）结合蛋白（按辅基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白组蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白简单蛋白质分类缀合蛋白质分类依据蛋白质的外形分类

球状蛋白质：

globularprotein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：

fibrousprotein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。膜蛋白：与细胞的膜系统结合，疏水氨基酸在分子外部，不溶于水但能溶于去污剂溶液。

根据蛋白质的溶解度分类

1.清蛋白（白蛋白）易溶于水、中性盐、稀酸、稀碱，被饱和硫酸铵沉淀。甘氨酸含量较少。

2.球蛋白可被半饱和硫酸铵沉淀。（1）拟球蛋白（假球蛋白）溶于水。（2）优球蛋白不溶于水，溶于稀盐例：肌球蛋白，血清球蛋白等。

3.组蛋白组成染色体的蛋白质，含Arg和Lys较多。呈碱性。例：H1，H2a，H2b，H3和H4等根据蛋白质的营养价值分类1.完全蛋白质含有人体必需的各种氨基酸。2.不完全蛋白质缺乏人体必需的某种氨基酸。（二）蛋白质的形状与大小

1.形状

2.大小球状蛋白纤维状蛋白膜蛋白蛋白质分子量为6000到1×106

更大一些。最小的分子量为5700。多肽中一个氨基酸残基的分子量为110。蛋白质结构的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredoman蛋白质结构的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredoman

-折叠片

-螺旋体

松散肽段亚基三级结构四级结构蛋白质分子的构象示意图Levelsofstructureinproteins蛋白质的主要功能：催化调节转运储存运动结构成分支架作用防御与进攻异常功能（四）蛋白质功能的多样性

1、催化功能酶（淀粉酶）

2、调节功能激素（胰岛素）

3、运动功能肌球蛋白

4、运输功能血红蛋白

5、防御功能免疫球蛋白

6、储存功能酪蛋白

7、结构成分胶原蛋白

8、支架作用微管蛋白

9、异常功能甜蛋白（应乐果蛋白）蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。蛋白质的结构

蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构，二级结构，三级结构和四级结构（不总是有）。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。维系蛋白质一级结构的主要化学键为肽键。蛋白质一级结构与蛋白质共价结构肽键二硫键肽(peptide)

肽键与肽链：蛋白质是由若干氨基酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构?者称多肽。Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（一）肽和肽键的结构肽平面肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。

0.127nm键长=0.132nm

0.148nm肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。2.肽键（反式）3.肽单位肽的结构4.肽平面肽键具有一定程度的双键性质，参与肽键的六个原子C、H、O、N、Cα1、Cα2不能自由转动，位于同一平面，此平面就是肽平面。5.肽的二面角

二面角

两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角。φ和ψ称作二面角，亦称构象角。肽基的C、O和N原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转

形成酰胺平面

产生键的平均化

肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体（二）肽的物理化学性质

1.物理性质

2.化学性质离子晶体，熔点很高，在PH0～14范围内酰胺氢不解离，酸碱性质主要决定于α-NH2和α-COOH以及R基团。和氨基酸一样，游离的α-NH2和α-COOH以R基团可以发生和氨基酸中相应的基团的反应。特殊的反应为双缩脲反应。生物活性肽：生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。1.谷胱甘肽（GSH）：全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。

谷胱甘肽(glutathione)

谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

2.多肽类激素：种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。

鹅膏蕈碱促甲状腺素释放因子（TRH）胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。

蛋白质一级结构的测定测定蛋白质的一级结构的主要意义：蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。主要意义：一级结构是研究高级结构的基础。可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。可以为生物进化理论提供依据可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。1，样品必需纯（>97%以上）；（分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。）2，知道蛋白质的分子量；3，知道蛋白质由几个亚基组成；4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。（取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。）

5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质的一级结构的要求蛋白质的氨基酸组成分析三、蛋白质一级结构的测定◆

（一）蛋白质测序的策略◆

（二）N-末端和C-末端氨基酸的鉴定◆

（三）二硫桥的断裂◆

（四）氨基酸组成的分析◆

（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化◆

（六）肽段氨基酸序列的测定◆

（七）肽段在多肽链中次序的决定◆

（八）二硫桥位置的确定◆

（九）蛋白质测序举例◆（十）蛋白质序列数据库（一）蛋白质测序的策略（片断重叠法）

1.测定蛋白质分子中多肽链的数目

2.拆分蛋白质分子的多肽链

3.断开多肽链内的二硫桥

4.分析每一条多肽链的氨基酸组成

5.鉴定多肽链N-末端和C-末端残基

6.裂解多肽链成较小的片段

7.测定各肽段的氨基酸序列

8.重建完整多肽链的一级结构

9.确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥测定步骤

蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：

1.测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

2.多肽链的拆分几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).3.二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。ssHcoooHSO3HSO3H(过甲酸）5.分析多肽链的N-末端和C-末端多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。4.测定每条多肽链的氨基酸组成

水解氨基酸分析仪（二）N-末端和C-末端氨基酸的鉴定N-端Sanger法（二硝基氟苯反应）

DNS法（丹磺酰氯反应）

Edman法（苯异硫氰酸脂反应）

氨肽酶法

C-端肼解法

还原法

羧肽酶法Sanger因创造了蛋白质一级结构和DNA序列的测定方法两次获诺贝尔奖。DNFB（2，4-二硝基氟苯，Sanger试剂）。DNFB只与蛋白质的游离末端氨基酸的氨基反映，脱去一分子HF，形成DNP多肽或DNP蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP-多肽经酸水解后，只有N-末端氨基酸为黄色的DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。其溶于乙酸乙酯。后可用色谱提取分离。虽然可能和侧链氨基反应，但产物不溶于乙酸乙酯。FrederickSangerCambridgeBorn1912

Nobelprice1958and1980Sangerdevelopedmethodsforsequencingbothproteinsandnucleicacids,andgotthepricetwice.InsulinDNFB法分析N-端氨基酸残基Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。二硝基氟苯（DNFB）法1953，FrederickSangerhasSequencedthefirstprotein(peptide)在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。丹磺酰氯法Edman反应-苯异硫氰酸酯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTH-肽）。在酸性有机溶剂中加热，得到PTH-氨基酸,其它肽链是完整的。PTH-氨基酸经有机溶剂抽提后可以用色谱法进行鉴定。苯异硫氰酸酯(PITC)法

弱碱

AAPITC+多肽蛋白

AAPTC—多肽蛋白酸性有机溶剂PTH-AA+少一个AA的多肽或蛋白（乙酸乙酯）氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。氨肽酶法肼解法分析C-端氨基酸残基此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。肼解法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。羧肽酶法6.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：可获得较大的肽段溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。多肽链断裂法：酶解法和化学法胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用Trypsin

：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。肽链水解位点胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。肽链水解位点糜蛋白酶Pepsin：R1和R2＝R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。肽链水解位点胃蛋白酶thermolysin)：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶溴化氰（BrCN）的裂解作用

它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。

7.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。

Edman

（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。Edman降解法测定氨基酸序列异硫氰酸苯酯氨基酸自动测序仪8.确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。示例(十肽的水解)

A法水解得到四个小肽：

A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到三个小肽：

B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val9.确定原多肽链中二硫键的位置。一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，(切点多，二硫键稳定)再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。Brown及Hartlay的对角线电泳技术+--第二向第一向abBrown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段+ShortpolypeptidesaresequencedusingautomatedproceduresBreakingdisulfidebondsinproteins

LargeProteinsMustBeSequencedinSmallerSegm