生物分离工程电泳

生物分离工程电泳1第1页，课件共30页，创作于2023年2月电泳在生化分离中的应用分离和纯化手段（实验室）

蛋白、酶、核酸纯化基础理论研究

醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白

琼脂对流免疫电泳分析病人血清，早期诊断肝癌

高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；

凝胶电泳技术分离分析酶，蛋白质，核酸2第2页，课件共30页，创作于2023年2月电泳原理指带电粒子在电场中朝与自身带相反电荷的电极移动的现象CATHODEANODE+--+3第3页，课件共30页，创作于2023年2月带电颗粒小离子：Cl-,甘氨酸离子

生物大分子：蛋白质、核酸等

蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基和羧基，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下就会解离而带电

4第4页，课件共30页，创作于2023年2月用支持体的电泳技术1.滤纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳4.非凝胶性支持体区带电泳(淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)5.凝胶支持体区带电泳(聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶)不用支持体的电泳技术Tiselius或微量电泳

操作形式：1.区带电泳2.等速电泳3.等电点电泳电泳形式分类5第5页，课件共30页，创作于2023年2月电泳速度v=EZe/(6пrη)+--Z，rEf’fE:电场强度,V/cmZ:

溶质的荷电荷数η：溶液粘度e:1.610-19C1.粒子在电场中所受的力:

f=EZe2.粒子在液体中泳动所受的阻力：根据Stoke定律f′=6пrηv平衡时：f=f’恒定泳动速度:溶质的迁移率：u0=v/E=Ze/(6пrη)6第6页，课件共30页，创作于2023年2月区带电泳7第7页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素FrictionCharge外加电流电压分子量分子形状分子的等电点Voltage+--+8第8页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-1

带电颗粒的性质

所带净电荷的数量

颗粒大小

形状

v=EZe/(6пrη)恒定泳动速度:9第9页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-2

粒子的pI和溶液pH值

protein白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.05.065.17.1白蛋白

>

α2球蛋白

>β球蛋白

>γ球蛋白血清中的四种蛋白pH8.6的电泳缓冲液中电泳，泳动速度：10第10页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-3

外加电流电压

U，E，v(1)常压电泳:

U=100~500V，E=2~10V/cm

t=几小时至数天

适合于分离蛋白质等大分子物质(2)高压电泳：U=500~1000V，E=50~200V/cm

t=几分钟

分离氨基酸，肽，核苷酸，糖类等小分子物质

由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置

v=EZe/(6пrη)恒定泳动速度:11第11页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-4

溶液的离子强度I=(∑cizi2)/2

—保持足够缓冲能力前提下，离子强度要最小—溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快

—最适离子强度0.02–0.2

12第12页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-5

电渗作用

在电场中液体对固体支持物的相对移动滤纸电泳CellulosepH=8.6电泳血清蛋白+-γ球蛋白-滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷与带电颗粒一样可以吸引正离子介质向阴极移动γ球蛋白:颗粒大，净电荷少13第13页，课件共30页，创作于2023年2月电渗作用—石英毛细管电泳

CapillaryElectrophoresis

pH>3内表面带负电毛细管管壁分布有

大量的硅烷醇（Si-OH）阳离子被吸附在管壁而形成了双电层

V=V(电渗流)＋V(电泳)V(正)>V(中)>V(负)14第14页，课件共30页，创作于2023年2月影响泳动速度的因素-6

对支持物的选择

支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离

琼脂糖和淀粉在电场作用下易电离带负电荷，产生电渗流，应用范围受限制。聚丙烯酰胺凝胶常用。15第15页，课件共30页，创作于2023年2月Example1

计划在0.82v/cm的电位梯度下，用凝胶电泳的方法将两种胞外蛋白质分离开来，这两种蛋白质的迁移率分别为4.110-5和5.110-5cm2/V.s。如果开始时混合物在凝胶上宽度为0.2cm，估计把这两种蛋白质分开需多长时间？在估算时，可忽略扩散的影响。

u0=v/E=eZ/（6пrη）解：溶质的迁移率为：16第16页，课件共30页，创作于2023年2月凝胶电泳17第17页，课件共30页，创作于2023年2月

凝胶电泳法铸胶电泳染色脱色凝胶电泳样本处理Trypsin浓缩层胶体分离层胶体取出胶体染色脫色18第18页，课件共30页，创作于2023年2月Pierce商品供应预铸胶片梯度或固定浓度胶体10,12.15样本槽中性pH缓冲液拋弃式塑料外壳胶体1mm厚度19第19页，课件共30页，创作于2023年2月不连续凝胶电泳系统组成1电泳系统pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液2样本溶液3浓缩层胶体6.84分离层胶体胶体5下层(正极)缓冲液Tris-HClTris-HClTris-glycineTris-glycineTris-glycine8.38.38.38.35%7.5~20%---●胶体不连续性有浓缩样品的作用20第20页，课件共30页，创作于2023年2月浓缩层内的等速电泳21第21页，课件共30页，创作于2023年2月浓缩层胶体中的三个主要作用角色Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子22第22页，课件共30页，创作于2023年2月SDSGelElecrtophoresis23第23页，课件共30页，创作于2023年2月SDS测定蛋白质相对分子量PAGE凝胶电泳分离、检测蛋白质根据蛋白质分子大小、形状及净电荷

在PAGE中加入一定量的SDS

蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子量大小24第24页，课件共30页，创作于2023年2月SDS测定蛋白质相对分子量SDS：阴离子去污剂、水溶液中以单体和分子团存在。能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的非共价键，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团。25第25页，课件共30页，创作于2023年2月SDS测定蛋白质相对分子量操作：分离胶12%浓缩胶5%加样电泳染色、脱色凝胶干燥确定分子量26第26页，课件共30页，创作于2023年2月样品分子量的确定M为蛋白质分子量、m相对迁移率、b为斜率、K为截距。一定条件下K和b为常数，根据迁移率可求得分子量。lgMw=b*mR+K

蛋白质分子量在15000-200000之间时，电泳迁移率与分子量的对手呈线性关系：27第27页，课件共30页，创作于2023年2月样品分子量的确定相对迁移距离=蛋白质迁移距离/燃料迁移距离

以标准蛋白质相对分子量的对数(lgMr)为纵座标，相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。28第28页，课件共30页，创作于2023年2月三种不同性质蛋白质的电泳比较MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+29第29页，课件共30页，创作于2023年2月单元体分子量的测定：SDS