荧光免疫技术（免疫学检验课件）

第十六章荧光免疫技术

免疫荧光技术

免疫荧光分析(Immunofluorescenceassay，IFA)始创于40年代初，是免疫标记技术中最早的检测方法。1942年Coons等多次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。

用荧光素标记Ab或Ag，与待测标Ag或Ab结合，通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或Ag。AbF（AgF）+Ag（Ab）AbF-Ag/（AgF–Ab）荧光激发光检测

分类荧光免疫分析

（定量）荧光抗体技术（定位、定性）荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光检测技术的敏感性和直观性相结合而建立的一种标记免疫技术。荧光抗体技术荧光免疫测定非均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定---荧光偏振免疫测定荧光免疫技术均相荧光免疫测定（一）荧光抗体技术：用荧光素标记抗体与组织切片或细胞表面的抗原反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，在荧光显微镜下直接观察特异性荧光（定性）。（二）荧光免疫测定技术：以荧光物质标记抗体或抗原，与相应抗原或抗体结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对固体或液体标本中微量物质定量测定。第一节基本知识一、荧光的基本知识荧光：某些物质吸收外部能量（激发光）的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其从激发态回复至基态时，过剩的能量以电磁波的形式发射称为发光。分子或原子吸收了外界给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光效率：荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率。吸收光的光量子数（激发光强度）荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）发射光谱：固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光谱。激发态电子回到的能级不同，发出的波长也不同激发光谱：固定检测发射光，用不同波长的激发光激发样品所记录到的荧光谱。荧光寿命：

指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的淬灭：

荧光物质在某些理化因素或受到激发光较长时间的照射作用，会发生发射荧光减弱甚至消退的现象。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。

*荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；消除非特异性荧光（本底）的干扰。Stokes位移荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。荧光偏振荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出单一平面的偏振荧光的现象。

荧光素能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。每一种荧光素有特定的激发光（吸收），发射出固定波长的荧光，荧光有红，橙，黄，绿，青，蓝，紫；但常用的有绿，红和蓝。

二、常用的荧光物质常用的荧光素主要有：异硫氰酸荧光素(FITC)

，最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈黄绿色荧光。四乙基罗丹明(RB200)

，最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595~600nm，呈明亮橙色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)

，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490nm-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术碘化丙啶（PI）488nm620nm橙红色Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质最大吸收光谱（nm）最大发射光谱（nm）荧光颜色应用FITC490~495520~530黄绿色FAT、荧光偏振免疫测定流式细胞术RB200570595~600桔红色FITC的衬比染色或双标记FATTRITC550620橙红色FITC的衬比染色或双标记FAT，也可单独采用PE488、532575红色可与FITC共用488nm激发光双标记FAT、流式细胞术ECD488620桔红色流式细胞术PeCy5488、532670红色流式细胞术PeCy7488、532755深红色流式细胞术PI488620橙红色DNA染色APC633670红色双激光管的仪器分析Eu3+螯合物340613时间分辨荧光免疫测定表16-1常用荧光物质的荧光特点FITCTRITC（二）影响荧光的因素1.pH：每种荧光素有其合适的pH。2.温度：温度对荧光有明显的影响。温度≥20℃时荧光开始淬灭；温度越高淬灭作用越强。温度在20℃以下，荧光强度恒定。3.荧光素的浓度：一定浓度范围内，荧光强度随荧光素的浓度增加而增加，当浓度达到一定程度时，荧光强度达到最强，若再增加浓度荧光强度反而逐渐下渐。4.试剂中杂质：溴化物、碘化物和苯胺对荧光有淬灭作用5.细胞固定剂：戊二醛、甲醛对荧光有淬灭作用。三、荧光抗体的制备（一）荧光素标记物的制备1.抗体的要求：抗体应具有高特异性、高纯度和高亲和力，经纯化后标记。2.荧光素要求：结合后不易解离，而未结合的易于去除，结合后仍保持较高的荧光效率和不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，结合物稳定，安全无毒，易于保存。标记方法方法学评价搅拌法待标记的蛋白质在磁力搅拌下加入FITC溶液标记体积大、蛋白含量高的抗体，标记时间短，荧光素用量少，但影响因素多，易引起非特异性染色。透析法待标记的蛋白质装入透析袋后置于FITC的缓冲液中过夜标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，标记均匀，非特异性荧光染色弱，但荧光素用量较大。荧光素标记抗体的方法：见表8-2。(1)去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤;(2)去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法;(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收。荧光素标记抗体的纯化

荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特异性、抗体抗体特异性染色滴度。

加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。荧光素标记抗体的鉴定荧光记抗体的保存第二节荧光免疫显微技术

用荧光物质标记抗体，让其与相应抗原结合后，借荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光的存在情况及其存在的部位和强度，以判断抗原或抗体存在的位置、分布和含量。

荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。一、检测原理（荧光抗体技术）

以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记抗体或抗抗体，检测组织切片中的细胞抗原或血清中的抗体，观察特异性荧光，用于样本的定性和定位检查。组织切片中的荧光（一）直接法荧光素标记抗体FF抗原二、方法类型固定Ag（待测）＋Ab*——AgAb*快，直接、干扰因素少；常用于检测Ag

特异性高但敏感度偏低检测一种Ag，需标记一种Ab，较麻烦Ag？

AbF直接法

滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。

（二）间接法FF荧光素标记抗抗体抗原抗体（1）抗原间接定位法荧光标记的第二抗体（二抗）组织中的抗原第一抗体（一抗）（2）抗体间接定位法荧光标记抗体组织中的抗体抗原

制备一种荧光抗体，可检测多种Ag或Ab既可检测Ag，又可检测Ab。灵敏度高间接法荧光素标记抗抗体AgAb抗－Ab*间接法：此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备多种荧光素标记的抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。间接法有时易产生非特异性荧光（特异性低），为其缺点。

用两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，对同一标本进行荧光染色，洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激发光激发，若有两种抗原存在，可显示两种颜色的荧光。（三）双标记法双标记法两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一标本不同抗原表位反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。如：具CD3、CD4表位的Th细胞。ThCD3CD4（FITC黄绿）（RB200橘红）（1）直接法A荧光标记的抗甲抗原抗体B荧光标记的抗乙抗原抗体甲抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体甲抗原乙抗原（2）间接法乙荧光标记二抗甲荧光标记二抗操作特异性非特异性敏感性临床应用直接法简便强少偏低测一种抗原间接法复杂强易出现高检测多种抗原或抗体补体法复杂强易出现高检测多种抗原或抗体双标记法较简便强少较高测两种抗原表8-3不同荧光免疫显微技术的比较Actin免疫荧光染色（cy3标记）FITC-细胞桨；DAPI-细胞核三、关键技术1.标本制作2.荧光抗体染色3.荧光显微镜检查4.荧光抗体染色结果判读一、标本的制作1.抗原在染色、洗涤和封埋过程中应保持抗原的完整性。2.标本切片要求薄。3.常见的临床标本有组织、细胞和细菌三大类，可制作成涂片、印片或切片。4.除活细胞外，其他标本片应固定。（二）荧光抗体染色于已固定的标本上滴加经相关试剂（含适当稀释的荧光抗体），置湿盒内25℃～37℃温育30分钟左右或4℃过夜；然后用PBS充分洗涤，待干燥后镜检。（三）荧光显微镜检查

光源：高压汞灯氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野相差聚光器镜头：消色差镜头

荧光显微技术特点荧光显微镜技术特点△分辨率高、对比度高，荧光显微镜的对比度约为普通显微镜的一百倍，可以观察到普通显微镜看不到的结构和细节。△可直接显示细胞内的生物化学成分；并且显示的彩色效果明显，极易观察和定量分析。△方法简单易行，得出结果迅速，适用于生命科学研究、医学临床诊断。△所用染色的荧光色素的量极其微小，浓度很低，对机体无毒，有利于活体观察。△一种先进的特异性示踪技术。光源－汞灯1.光源：100W汞灯

HBO100

汞灯为气体灯，它的功率一般在50W-200W范围内，寿命为200H左右。汞灯的光谱不是连续均匀的，汞灯的光谱多数在紫外附近，其强度的最高点在313、334、365、406、435、546和578纳米。这样的光一般不用作显微镜的普通照明。使用合适的滤色片，可在选定的区域内产生546纳米绿色线、435纳米兰色线和365或406纳米紫外线等极好的单色光。光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头荧光显微镜的基本结构隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。滤光片荧光显微镜的基本结构透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜的基本结构

阳性细胞显色有均质型、核膜型、斑点型核仁型，显色深浅可作为抗原定性、定位和定量依据。“-”为无或仅见极微弱荧光；“+”为荧光较弱但清楚可见；“2+”为荧光明亮；“3+”为耀眼的强荧光。“2+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

结果判定

注意事项

标本应新鲜，立即处理或及时冷藏，力求保持抗原性和组织细胞结构完整。陈旧标本的自身荧光和非特异性吸附的荧光将会增强，影响荧光免疫检测结果和灵敏度。1.血清中自身抗体的检测；2.病原体快速鉴定及血清中抗体检测；3.免疫病理组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测；4.恶性肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定；5.细胞表面抗原和受体检测；6.鉴定和计数T、B细胞及其亚群。

临床应用①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)四、应用与评价②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）④细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

⑤特殊应用：流式细胞分析荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。

第三节时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

时间分辨荧光免疫检测系统（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨技术相结合而建立的一种新型超微量物质免疫分析方法，具有灵敏度高、特异性强、发光稳定、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等特点，已在临床实验中广泛应用。

镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标记物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质的荧光寿命时间分辨荧光免疫测定自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光时间分辨检测原理示意图时间分辨荧光免疫测定发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少

激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高时间分辨短寿命荧光长寿命荧光Eu3+元素的stokes位移二、方法类型12

3双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法Eu增强液激发Eu固相Ab待检AgEu标记Ab每一步均需洗涤Eu解离发光双抗体夹心法增强液激发固相AbAg？AgEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗体竞争法增强液激发固相AgAg？AbEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗原竞争法四、临床应用广泛用于微量或超微量物质的检测，如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物及病毒抗原等的测定。灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定

根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定液体中小分子物质的含量。荧光偏振免疫测定原理示意图

第四节荧光偏振免疫测定光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质基本原理

抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图基本原理荧光偏振免疫测定方法评价

样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定第五节免疫芯片技术一、免疫芯片的检测原理

将几个、几十个，甚至几万个或更高数量的抗原(或抗体)高密度排列在固相载体上，形成高密度抗原或抗体微点阵的免疫芯片，与少量待检样品或生物标本同时进行特异性免疫反应，可一次获得芯片中所有已知抗原(或抗体)的检测结果。免疫芯片的检测原理图1.芯片阵列项目要求合理组合2.设计阵列组合中的抗体要配齐，有阵列抗体库3.微阵列点样制备系统将抗体或抗原固化4.所有抗原抗体集中在同一张芯片的微细结构内反应5.用同位素、荧光、化学发光、酶的成色反应等显示结果，通过扫描仪或CCD摄像技术记录和计算机软件分析综合成可读的生物样品信息二、免疫芯片的